本发明属于发酵工程领域，特别涉及一种提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法。
背景技术：
氨基葡萄糖的用途十分广泛，主要应用于食品、医疗、化妆品、农牧业等领域。目前，氨基葡萄糖最多的被用于关节炎的预防和治疗。氨基葡萄糖是结缔组织与软骨细胞的主要成分，如果关节发生病变，补充氨基葡萄糖可以修补受损的软骨，增加关节间的润滑。
现在，我国氨基葡萄糖的生产大多以壳聚糖为原料生产，但是存在原料来源不稳定，一些人群存在过敏反应等缺点。虽然微生物发酵法生产N-乙酰氨基葡萄糖，(在含有N-乙酰氨基葡萄糖的发酵液中，加入0.1mol/L的盐酸，100℃下反应3h，可以把90％以上的N-乙酰氨基葡萄糖转化为氨基葡萄糖。)可以克服以上缺点，但微生物发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖存在产量低、转化率低和副产物乙酸、谷氨酸含量高的现象，因此，需要开发一种N-乙酰氨基葡萄糖的发酵新工艺，以提高N-乙酰氨基葡萄糖的发酵产量和转化率，同时降低发酵副产物乙酸、谷氨酸的含量。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，提供一种提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法，在N-乙酰氨基葡萄糖发酵过程中，向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中流加甜菜碱溶液。
优选地，所述流加甜菜碱溶液的质量浓度为5％-15％，进一步优选为10％(m/m，即质量/质量，下同)。
优选地，所述流加甜菜碱溶液的速率为0.1-0.8g/L·h，进一步优选为0.2-0.5g/L·h。
上述流加速率的含义是每1L N-乙酰氨基葡萄糖发酵液每1h流加0.1-0.8g的甜菜碱溶液(例如质量浓度10％(m/m))的甜菜碱溶液的速率为0.1-0.8g/L·h。
优选地，当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中OD660nm＝28-33(优选OD660nm＝30-32)时，向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中流加甜菜碱溶液。
进一步优选地，在流加甜菜碱溶液前先加IPTG(即异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)进行诱导；具体地，当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中OD660nm＝28-33(优选OD660nm＝30-32)时，先向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中加入IPTG，再流加甜菜碱溶液。
优选地，所述IPTG的添加量为0.03mM-0.10mM；进一步优选为0.05mM-0.08mM。
优选地，添加IPTG进行诱导是时控制N-乙酰氨基葡萄糖发酵液的温度为33-35℃。
为进一步提高N-乙酰氨基葡萄糖的产量，上述发酵方法中还包括在发酵过程中，当发酵液的残糖含量降至0.5g/L以下时，按照5-8g/L·h的流加速率向发酵液中流加葡萄糖溶液，同时向发酵液中流加尿素溶液。流加尿素时，葡萄糖仍同时流加。进一步地，所述尿素溶液的流加速率与葡萄糖溶液的流加速率之比为1:10。
进一步地，所述葡萄糖溶液的质量浓度50％-60％，优选为55％。
进一步地，所述尿素溶液的质量浓度15％-20％，优选为15％。
具体的，上述提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法包括以下步骤：
(1)种子培养
配制种子培养基，用浓度为25％(m/m)的氨水调种子培养基pH值至6.8-7.3，向种子培养基中通饱和蒸汽至121℃，保温30min；设定种子培养条件：温度37℃，罐压0.05mPa，通风比1:0.5，转速300rpm，pH值6.8-7.3；接入产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌进行培养，当种子培养基中OD660nm＝3.5-5范围区间时，作为种子成熟标准；
进一步地，所述种子培养基为：葡萄糖15g/L(单消)，磷酸氢二钾11g/L，磷酸二氢钾16g/L，酵母浸粉1g/L，苏氨酸0.2g/L，蛋氨酸0.15g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸铵5g/L，硫酸锰0.013mg/L，硫酸铁0.024mg/L，硫酸锌0.047mg/L，氯化钴0.01mg/L。
(2)发酵培养
配制发酵培养基，121℃灭菌30min；降温后设定发酵培养条件：温度37℃，罐压0.03-0.05mPa，通风比1:0.5-1:1，转速300-500rpm，pH值6.9-7.0(可在发酵全程用25％(m/m)氨水调控)；将成熟的N-乙酰氨基葡萄糖种子液按照10％(V/V)接种量接种到发酵罐进行培养，发酵过程中通过调节罐压、风量、转速控制溶氧30-40％；
当N-乙酰氨基葡萄糖发酵培养过程中发酵液残糖降至0.5g/L以下时，按照6g/L·h的流加速率向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中流加55％(m/m)葡萄糖溶液；同时按照0.6g/L·h的流加速率向发酵液中流加15％(m/m)尿素溶液。
当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液OD660nm＝30-32区间时，降温至33-35℃，同时一次性加入0.05mM-0.08mM IPTG进行诱导，再按照0.2-0.5g/L·h的流加速度向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液流加10％(m/m)甜菜碱溶液。
本发明根据发酵后期不产N-乙酰氨基葡萄糖或者产N-乙酰氨基葡萄糖较慢来判断发酵终点，培养52-56小时可以达到发酵终点，优选培养54小时。
进一步，所述发酵培养基为：葡萄糖5g/L(单消)，磷酸氢二钾16g/L，磷酸二氢钾10g/L，酵母浸粉0.3g/L，酵母膏0.1g/L，苏氨酸0.1g/L，蛋氨酸0.15g/L，硫酸镁0.25g/L，硫酸铵3g/L，氯化钾0.1g/L，硫酸锰0.015mg/L，硫酸铁0.35mg/L，硫酸锌0.41mg/L，氯化钴0.02mg/L。
本发明所述OD660nm是指在波长660nm可见光下测定的发酵液的吸光值。
本发明所述种子培养基、发酵培养基的溶剂均为水。
本发明提供的提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法能够刺激细胞呼吸，提高菌种的氧消耗速率，显著提高发酵终点N-乙酰氨基葡萄糖含量和转化率。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
在下述实施例和对比例中：
OD值测定：采用7230G可见分光光度计，在波长660nm可见光下测定吸光值。
按照GB/T5009.7-2008的方法测定还原糖的浓度。
N-乙酰氨基葡萄糖含量测定：高效液相色谱法。
乙酸含量测定：高效液相色谱法。
谷氨酸含量测定：取发酵液离心后的上清液，稀释到残谷氨酸浓度在1g/L以内，用生物传感分析仪测定。
转化率(％)＝N-乙酰氨基葡萄糖量/总耗糖量×100％。
实施例1
提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法，包括以下步骤：
(1)种子培养
配制种子培养基：葡萄糖15g/L，磷酸氢二钾11g/L，磷酸二氢钾16g/L，酵母浸粉1g/L，苏氨酸0.2g/L，蛋氨酸0.15g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸铵5g/L，硫酸锰0.013mg/L，硫酸铁0.024mg/L，硫酸锌0.047mg/L，氯化钴0.01mg/L。
投入到50L发酵罐中，用浓度为25％(m/m)的氨水调种子培养基pH值至7.3，向种子培养基中通饱和蒸汽至121℃，保温30min；设定种子培养条件：温度37℃，罐压0.05mpa，通风比1:0.5，转速300rpm，pH值6.8-7.3。接入产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌进行培养，当种子OD660nm＝3.5-5范围区间时，作为种子成熟标准。
(2)发酵培养
配制发酵培养基：葡萄糖5g/L(单消)，磷酸氢二钾16g/L，磷酸二氢钾10g/L，酵母浸粉0.3g/L，酵母膏0.1g/L，苏氨酸0.1g/L，蛋氨酸0.15g/L，硫酸镁0.25g/L，硫酸铵3g/L，氯化钾0.1g/L，硫酸锰0.015mg/L，硫酸铁0.35mg/L，硫酸锌0.41mg/L，氯化钴0.02mg/L。
投入到50L发酵罐中，121℃，灭菌30min，降温后设定发酵培养条件：温度37℃，罐压0.03-0.05mpa，通风比1:0.5-1:1，转速300-500rpm，发酵全程用25％(m/m)氨水自控pH值为7.0。将成熟的N-乙酰氨基葡萄糖种子液按照10％(V/V)接种量接种到发酵罐进行培养，发酵过程中通过调节罐压、风量、转速控制溶氧30-40％。
当N-乙酰氨基葡萄糖发酵培养过程中残糖降至0.5g/L以下时，按照6g/L·h的流加速率向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液中流加55％(m/m)葡萄糖溶液；同时按照0.6g/L·h的流加速率向发酵液中流加15％(m/m)尿素溶液。
当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液OD660nm＝30-32区间时，降温至33℃，同时一次性加入0.05mM IPTG进行诱导，此时按照0.2g/L·h的流加速度向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液流加10％(m/m)甜菜碱溶液。
根据发酵后期不产N-乙酰氨基葡萄糖或者产N-乙酰氨基葡萄糖较慢来判断发酵终点，发酵培养周期54小时，N-乙酰氨基葡萄糖含量为107g/L，转化率为38.3％，乙酸含量为3.9g/L，谷氨酸含量为5.7g/L。
实施例2
提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法，与实施例1的区别仅在于：当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液OD660nm＝30-32区间时，降温至34℃，同时一次性加入0.06mM IPTG进行诱导，此时按照0.3g/L·h的流加速度向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液流加10％(m/m)甜菜碱溶液。
发酵培养54h时，N-乙酰氨基葡萄糖含量为110g/L，转化率为40.1％，乙酸含量为1.9g/L，谷氨酸含量为2.1g/L。
实施例3
提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法，与实施例1的区别仅在于：当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液OD660nm＝30-32区间时，降温至35℃，同时一次性加入0.07mM IPTG进行诱导，此时按照0.4g/L·h的流加速度向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液流加10％(m/m)甜菜碱溶液。
发酵培养54h时，N-乙酰氨基葡萄糖含量为98g/L，转化率为38.5％，乙酸含量为3.2g/L，谷氨酸含量为3.5g/L。
实施例4
提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法，与实施例1的区别仅在于：当N-乙酰氨基葡萄糖发酵液OD660nm＝30-32区间时，降温至35℃，同时一次性加入0.08mM IPTG进行诱导，此时按照0.5g/L·h的流加速度向N-乙酰氨基葡萄糖发酵液流加10％(m/m)甜菜碱溶液。
发酵培养54h时，N-乙酰氨基葡萄糖含量为101g/L，转化率为38.7％，乙酸含量为4.4g/L，谷氨酸含量为4.7g/L。
实施例5
提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法，与实施例1的区别仅在于：采用500L发酵罐进行N-乙酰氨基葡萄糖的发酵培养，发酵培养54h时，N-乙酰氨基葡萄糖含量为103g/L，转化率为38.4％，乙酸含量为3.5g/L，谷氨酸含量为4.9g/L。
对比例1
N-乙酰氨基葡萄糖的发酵方法，与实施例1的区别仅在于：IPTG诱导时温度维持37℃不变。发酵培养54h时，N-乙酰氨基葡萄糖含量为80.3g/L，转化率为31.1％，乙酸含量为2.1g/L，谷氨酸含量为2.5g/L。
对比例2
N-乙酰氨基葡萄糖的发酵方法，与实施例1的区别仅在于：IPTG诱导时，不流加甜菜碱溶液。发酵培养54h时，N-乙酰氨基葡萄糖含量为85.7g/L，转化率为36.1％，乙酸含量为1.8g/L，谷氨酸含量为2.7g/L。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。