本发明涉及一种基于流式细胞术的高通量筛选金霉素高产菌株的方法，属于高通量筛选技术领域。
背景技术：
金霉素(Chorotetracycline，即CTC)属于四环素类的一种广谱抗生素。金霉素能够抑菌、促生长、饲料利用率高、在肌体内残留量低。其生产技术已经较为成熟，生产成本也较低，成为目前饲料工业中用量最大的抑菌促生长剂。目前国内工厂金霉素的产率还较低(效价在18000μg/mL左右)，因此提高金霉素的产率很有必要。金霉素是由金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)发酵得到的次级代谢产物，其产量合成性状受多基因决定，代谢网络复杂。影响金霉素发酵过程的因素也很多，如种子的质量、培养基的组成、工艺条件以及发酵过程的代谢控制等。目前微生物育种技术已经从诱变、推理、重组技术发展到代谢工程、系统生物学和异源生物合成等方法。但传统诱变育种仍具有诸多优势。如不需要知道生物遗传背景、代谢模型，只需要获得有效突变库和定向筛选。高通量筛选与常规诱变结合，适用于以提高次级代谢产物产量为目标的工业生产菌株选育，尽可能减少漏筛现象。
目前的经典诱变结合高通量筛选方法，由于经典诱变会存在大量死细胞而可能导致后续可培养无法实现，同时经典诱变后的菌株要进一步分离纯化、扩大培养之后才能进行后续酶标板等高通量筛选而存在筛选周期长等问题。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明联合经典诱变、流式细胞术、高通量孔板筛选、固液联合培养，提供了一种基于流式细胞术的高通量筛选金霉素高产菌株的方法。本发明基于流式细胞术对金霉素高通量筛选，可在短时间内对大量有效菌株进行分析，从而分选目的活孢子，进而进行高通量培养检测。
本发明的基于流式细胞术的高通量筛选金霉素高产菌株的方法，主要包括步骤如下：
(1)获得金色链霉菌的多个含量死孢子在内的待筛选的孢子；
(2)利用PI染料对步骤(1)的待筛选的孢子进行染色；
(3)使用流式细胞仪检测孢子活性；
(4)利用流式细胞仪分选有活性孢子，直接将单个有活性的孢子分选到装有固体培养基的高通量孔板中；
(5)待高通量孔板的固体培养基上培养2～3天，直接添加液体种子培养基继续培养得到种子液；将培养好的种子液转接入含有发酵培养基的新的高通量孔板中，发酵培养；
(6)配置一定浓度梯度的金霉素标准品，吸取Tris-HCl缓冲溶液、Sm(NO)3溶液、各浓度标准品溶液，震荡混匀至显色完全，用酶标仪检测，得到金霉素与405nm下的吸光值OD的关系；发酵培养结束后，取发酵液上清，在合适的浓度下加入到含有Tris-HCl缓冲溶液和钐溶液的孔板中，震荡混匀至颜色变为淡黄色，然后用酶标仪测定405nm下的吸光值OD，进而得知待筛选菌株产金霉素含量的相对高低；
(7)选取上一步得到的金霉素含量相对较高的菌株多株，进行复筛。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)的待筛选孢子可以是不同活性的孢子，包括死孢子。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)的待筛选孢子是将金色链霉菌进行诱变后得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)的待筛选的孢子中，死孢子含量达90％以上，优选地达95％以上更优选地达99％以上。
在本发明的一种实施方式中，所述诱变，可以是物理诱变或者化学诱变，比如常压室温等离子体(ARTP)诱变、紫外诱变、甲基磺酸乙酯(EMS)诱变、亚硝基胍(NTG)诱变、硫酸二乙酯(DES)诱变等等。。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)的染色，具体是：将待筛选的孢子调整至浓度105～106个孢子/mL的悬浮液，将等体积悬浮液与10μg/mL PI染色剂混合，避光放置4℃冰箱孵育20min。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)和步骤(4)具体是：以没有标记任何荧光素的样品为阴性对照、将完全无活性的与PI染色剂结合的样品设置为阳性对照，确定阴性与阳性孢子群体；取染色后的金色链霉菌孢子悬浮液，重新过滤，稀释一定倍数，上流式细胞仪分析，用FL3通道((610±15)nm)检测，将无荧光区域最集中部分设门分选至装有固体培养基的高通量孔板中，每孔分选设定为单个孢子。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(4)中，装有固体培养基的高通量孔板中固体培养基的体积为50μL/孔。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)中，是培养至长出可见孢子后添加液体种子培养基。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)中液体种子培养基的添加量为150μL/孔。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)中发酵培养液的添加量为900μL/孔。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(6)，在线性浓度范围内，目标物浓度越大，OD值越大。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(6)的一定浓度梯度是0～360μg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(6)，是绘制金霉素与405nm下的吸光值OD的标准曲线；发酵培养结束后，发酵上清液稀释至合适浓度，加入到提前添加了Tris-HCl缓冲溶液和钐溶液的孔板中，震荡混匀至颜色变为淡黄色，然后用酶标仪测定405nm下的吸光值OD，将吸光值OD代入标准曲线，得到相应的金霉素含量。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(6)，是将20μL Tris-HCl缓冲溶液、60μL Sm(NO)3溶液、120μL各浓度标准品金霉素溶液或者稀释后的发酵液震荡混匀。
在本发明的一种实施方式中，所述Tris-HCl缓冲溶液的pH为6.7，Sm(NO)3溶液的浓度为5×10-4mol/L。
在本发明的一种实施方式中，所述高通量孔板可以是96深孔板、96浅孔板、48深孔板、24深孔板、12深孔板等任意一种具有高通量筛选作用的培养器皿。优选地，装有固体培养基的高通量孔板为96浅孔板，装有发酵培养基的高通量孔板为48深孔板。
本发明的有益效果：
本发明方法结合了常压室温等离子体(ARTP)、PI染色法、流式细胞术分析分选法、酶标仪检测、固液结合的培养方法和高通量筛选技术，对分选有活性金色链霉菌孢子培养提供了一种精确快速的方法。本发明方法基于流式细胞仪能够在短时间内对单孢子检测，从而建立庞大的分析目标群体，流式细胞术高通量的分选培养减少了在平板上生长的过程，不漏筛每个孢子，分选速度和筛选效率得以提高。此外，利用固液结合的培养方法直接提高了单个金色链霉菌孢子的生长率，解决了单个孢子在液体培养基中生长困难的问题。
具体实施方式
培养基：
(1)固体培养基(g/L)：蔗糖20g，进口酵母粉0.5g，KH2PO40.8g，琼脂18g。
(2)种子培养基(g/L)：蔗糖30g，进口酵母粉5g，MgSO40.5g，(NH4)2SO43g，NaCl4g，KH2PO41g，CaCO30.2g。
(3)孔板发酵培养基(g/L)：蔗糖30g，MgSO40.5g，CaCO30.33g，柠檬酸2.55g，(NH4)2SO43g，1mL混合液(0.3％CuSO4·5H2O、0.5％ZnSO4·7H2O、0.25％MnSO4`4H2O)。
荧光染料配制：称取0.01g PI，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液定容至10mL。梯度稀释至10μg/mL。4℃避光保存。
PI染料对金色链霉菌孢子染色：
取等体积金色链霉菌孢子悬液和10μg/mLPI染料混合，避光放置4℃冰箱染色20min。
流式细胞仪检测：
取染色后的金色链霉菌孢子悬浮液，重新过滤，稀释一定倍数，上流式细胞仪(MoFlo XDP)分析。根据染色剂发射荧光选择合适通道检测。所得数据用Summit 5.4软件分析。
实施例1 ARTP诱变或其他诱变获得不同活性孢子
出发菌株金色链霉菌斜面菌种在34℃条件下，培养4天，直至孢子成熟，斜面菌落呈鼠灰色。刮取适量成熟斜面孢子于装有2mL PBS缓冲液的试管中，震荡器震匀制成菌悬液后，无菌滤纸过滤。吸取10μL合适浓度的菌悬液均匀涂布于无菌的载片表面，将载片置于载台上，用ARTP诱变仪进行诱变。条件：入射功率为100W、氦气流量为10SLM、分别照射一定时间获得不同活性的孢子。分别照射一定时间获得不同活性的孢子。其他物理、化学诱变也可获得不同活性的孢子。
实施例2 PI染料对金色链霉菌孢子染色：
取样品处理完毕，用无菌镊子将载片放至装有PBS(pH 7.4)缓冲溶液的EP管中，充分振荡1min，将附着在载片上的菌体被彻底洗脱到液PBS中。滤纸过滤，5000×g离心5min，弃去上清，加入PBS重悬。重复此操作步骤2～3次，得到纯净的金色链霉菌孢子悬液。用PBS将纯净的金色链霉菌孢子悬液稀释至浓度105～106个孢子/mL。等体积金色链霉菌孢子悬液和10μg/mLPI染料混合，避光放置4℃冰箱染色孵育20min。
实施例3流式细胞仪检测：
检测要建立对照试验除去非特异性结合即背景。没有标记任何荧光素的样品为阴性对照，代表细胞背景荧光信号。通过阴性对照调节基本电压，设定阴性与阳性群体界限。将完全无活性，与PI染色剂结合的样品设置为阳性对照，确定阴性与阳性孢子群体。固定条件后进行样品检测。取染色后的金色链霉菌孢子悬浮液，重新过滤，稀释一定倍数，上流式细胞仪(MoFlo XDP)分析。根据PI发射红色荧光波长，用FL3通道((610±15)nm)检测。通过调节FSC、SSC、荧光通道坐标参数，电压以及阈值参数，首先初步获得分析对象的群体位置。对群体位置大致设门，再次调节FSC、SSC阈值，电压参数，将大部分的背景噪音去除。所得数据用Summit 5.4软件分析。从软件图示中，可以看出，金色链霉菌无活性孢子被PI染色后，发出红色荧光信号。由于PI不能透过活细胞细胞膜，有活性金色链霉菌孢子未能被染色，无荧光信号显示。从而可以进一步分选出有活性的金色链霉菌孢子。
实施例4金霉素显色反应
根据金霉素与钐离子的显色反应作为初筛方法。金霉素与钐离子在近中性条件下形成浅黄色配合物，在405nm处有最大光吸收。考虑发酵结束后，培养基中含带有颜色的原料对测定结果产生一定影响。用生产发酵液配方，同时在孔板中培养与未培养菌体。结果表明，未培养菌体发酵液也有一定的OD值，说明发酵液本身的颜色对OD值得测定确实存在影响，但培养菌体的发酵液OD值大于未培养菌体的发酵液，因此发酵液本身颜色干扰并不影响筛选金霉素高产菌株。配置浓度在0.5～20mg/L的金霉素标准品溶液，依次吸取20μL Tris-HCl缓冲溶液，60μL Sm(NO)3溶液，120μL各浓度标准品溶液震荡混匀，10min后显色完全，酶标仪测定各浓度的OD405值。确定OD405与金霉素浓度C(mg/L)的回归方程：y＝0.0107x-0.006，R2＝0.99305。x为标准品浓度(μg/mL)，y为OD405nm，标准品浓度范围为0～360μg/mL。
实施例5高产菌株的培养及筛选
经过流式细胞仪直接将单个金色链霉菌孢子分选至96浅孔板中(培养基装量180μL)。由于金色链霉菌孢子体积过小，直接在液体培养基中生长率只有15％左右。为解决此问题，对培养方案进行改进。待装有50μL的96孔板固体培养基上长出可见孢子之后(约2～3d)，吸取种子培养液150μL于此孔板固体培养基上。在750r/min、30～32℃的孔板摇床上培养23～25h。经此改进后的培养方案，金色链霉菌在孔板固体培养基上生长率可达95％左右。以5％(v/v)的接种量，将96孔板中的种子液平行转接至48孔板(装有发酵培养液1000μL)中，750r/min，30～31℃发酵培养96～110h。剩余96孔板中的种子液用40％甘油保存于4℃冰箱。将48孔板获得的菌体离心后，吸取上清适当稀释，吸取120μL稀释液至96孔板(提前加入Tris-HCl缓冲溶液和钐溶液)，摇床震荡混匀20min，颜色变为淡黄色，利用酶标仪测定OD405值，挑选出金霉素相对含量较高的菌株进行摇瓶复筛实验。
摇瓶复筛结果显示，本发明方法准确性很高，能够从众多孢子中筛选得到金霉素产量相对较高的菌株。
此外，发明人还对比了本发明的基于流式细胞术与孔板高通量筛选的方法，和传统诱变与孔板高通量筛选直接结合的方法，发现本发明的方法筛选效果极好，不会漏筛具有活性的孢子，分选速度和筛选效率显著提高。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。