一株广谱抗病促生抗逆产氮假单胞菌及其应用的制作方法

文档序号:11936581来源:国知局
本发明属于微生物
技术领域
,涉及一株对番茄灰霉病、叶霉病、黄瓜褐斑病和刺五加根腐病等多种植物病害具有较强拮抗作用的产氮假单胞菌及其应用。
背景技术
:农作物病害的发生常常破坏植株的生长,威胁其产量及品质,造成巨大的损失。常见的植物病害的主要防治方法有选育抗病品种、化学防治和生物防治等。针对一些如番茄灰霉病、叶霉病、黄瓜褐斑病和刺五加根腐病等的常见病害,国内外在筛选抗资源材料方面做了较长时间的研究,一直未筛选出理想的抗源材料,抗病育种进展缓慢。而且化学农药的长期大量使用,会使病菌抗药性增强,农药残留危害人畜健康,此外,化学农药在杀死病菌的同时也杀死农田有益微生物,破坏农业生态系统。而生物防治可将病害控制在最低水平,其优点是低毒、低残留、低污染,对环境友好且安全、高效。“十三五”乃至今后更长时期农业工作更是将“保供给、保收入、保生态”确立为“三保”目标。搞绿保生态,就要减少农药、化肥的不合理使用,因此生态友好型的微生物农药成为农作物病害防治的重要手段。技术实现要素:本发明的目的是提供一株防治番茄灰霉病、叶霉病、黄瓜褐斑病和刺五加根腐病等植物病害的广谱抗病促生抗逆产氮假单胞菌及其应用,该菌株防治番茄灰霉病、叶霉病、黄瓜褐斑病和刺五加根腐病等常见农作物病害效果较好,并具有抑菌谱广、促进植物生长、改善果实品质、耐紫外耐干旱等特性,具有较高的应用价值,在生物防治中具有潜在的研究和开发优势。本发明的目的是通过以下技术方案实现的:一株广谱抗病促生抗逆产氮假单胞菌,它为产氮假单胞菌(Pseudomonasazotoformans)WXCDD51,以下简称为WXCDD51,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期为2016年7月12日,保藏编号为CGMCCNo.12760。WXCDD51形态特性:革兰氏阳性,不产芽孢;在LB培养基上菌落呈乳白色,圆形、突起、表面光滑,边缘整齐,会产生代谢物使培养基颜色变深棕色。WXCDD51生理生化特性:WXCDD51为好氧型细菌,能利用葡萄糖和果糖,氧化型产酸,其中硝酸盐还原反应、甲基红反应、V.P.试验呈阴性,淀粉水解、接触酶反应、明胶液化、柠檬酸盐利用试验呈阳性。生长温度范围4-37℃,最适生长温度是25-30℃。WXCDD51分子生物学鉴定结果:将WXCDD51菌株的16SrDNA序列提交到NCBI的GenBank数据库中并进行Blast比对,比对结果发现与其同源性较高的菌株均属于假单胞菌属(Pseudomonas),采用相似度97%以上的50株菌构建系统发育树,由构建出的系统发育树可看出,WXCDD51菌株与Pseudomonasazotoformans(D84009)在同一个分支上,这说明WXCDD51菌株与Pseudomonasazotoformans亲缘关系最近,相似性为98.75%。通过形态观察、生理生化特性鉴定和16SrDNA序列分析,将WXCDD51菌株鉴定为假单胞菌组中的Pseudomonasazotoformans。本发明的WXCDD51对番茄灰霉病菌和叶霉病菌菌丝生长均有显著抑制作用,对灰霉病菌及叶霉病菌菌丝生长量的抑制率分别为94.9%、90.7%。本发明的WXCDD51对番茄灰霉病和叶霉病的温室盆栽效果表明,先接种生防细菌后接种病原菌的防治效果灰霉病可达54.51%,叶霉病可达61.46%;先接种病原菌后接种生防菌的防治效果灰霉病可达45.27%,叶霉病可达50.61%。本发明的WXCDD51能够有效的抑制黄瓜枯萎病菌、甜瓜枯萎病菌、玉米茎基腐病菌、尖孢镰刀菌、西瓜枯萎病菌、水稻立枯病菌、刺五加根腐病菌、番茄枯萎病菌、黄瓜褐斑病菌、草莓灰霉病菌、黄瓜炭疽病菌、番茄斑枯病菌、玉米大斑病菌、葵花菌核病菌、链格孢等病原真菌的生长,抑菌谱较广,其中对草莓灰霉病和黄瓜褐斑病的抑制作用较强。本发明的WXCDD51菌悬液对番茄种子胚根的生长具有促进作用。不同浓度的WXCDD51菌悬液及不同处理时间对番茄种子胚根生长量的影响最高为CK的1.49倍,最低为CK的1.06倍,其中在稀释103倍菌悬液中浸泡3h时,胚根最长。本发明的WXCDD51对番茄果实营养品质没有产生不良的影响,具有改善果实品质的作用。经生防细菌处理的番茄果实腐烂率约为30%,而CK对照组的腐烂率达56%,生防细菌具有较好的贮藏防腐作用。由生防细菌处理过的番茄果实失重率明显低于对照组。贮藏第15d,WXCDD51和CK对照组的的硬度分别比第0d下降了28.6%和42.9%,生防细菌处理的果实相对于对照组硬度较高。贮藏结束时可溶性固形物、可滴定酸含量没有显著差别。本发明的WXCDD51能够在30℃培养箱中进行干燥培养长达30天。不同人工模拟的干旱处理条件下,菌数变化幅度不大,相比之下对照菌株在不同人工模拟干旱条件下菌数变化明显。经过10-180min不同时间段紫外线照射处理过的细菌液放置LB培养基上培养48h,均可正常生长。180min紫外照射的处理组与对照组相比,菌数几乎不变,抑菌活性也几乎保持一致。本发明的WXCDD51具有如下优点:1、与普通的生防菌株相比,具有优良的特性,对番茄灰霉病和叶霉病皿内平均仿效均能达到90%以上,并通过盆栽试验验证了生防细菌对番茄灰霉病和叶霉病的防治效果。2、不仅对番茄灰霉病和叶霉病的防治效果较强,而且能够抑制多种农作物枯萎病菌、玉米茎基腐病菌、水稻立枯病菌、刺五加根腐病菌、黄瓜褐斑病菌、黄瓜炭疽病菌、玉米大斑病菌、番茄斑枯病菌、葵花菌核病菌、草莓灰霉病菌、尖孢镰刀菌、轮枝镰刀菌、链格孢等真菌病害,抑菌效果均较好,抑菌谱较广,其中对草莓灰霉病和黄瓜褐斑病抑制作用较强。3、对番茄种子具有促生长作用,还能改善果实品质,降低腐烂率。4、具有耐紫外耐干旱的特性,能产生代谢物使培养基颜色变深棕色,辨识度高,可为下一步制备成生物农药做基础,并且制备方法简单,成本低廉,是一株性能优良的生防菌株,具有良好的开发应用前景。保藏信息:分类命名:产氮假单胞菌(Pseudomonasazotoformans);保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC);保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号;保藏日期:2016年7月12日;保藏编号:CGMCCNo.12760。附图说明图1为菌株WXCDD51的筛选结果,a为对番茄灰霉病的抑制作用,b为对番茄叶霉病的抑制作用;图2为菌株WXCDD51的菌落形态;图3为菌株WXCDD51的发育树;图4为生防细菌对灰霉病菌菌丝生长量的抑制作用;图5为生防细菌对叶霉病菌菌丝生长量的抑制作用;图6为不同浓度的WXCDD51菌悬液及不同处理时间对番茄种子胚根生长量的影响,其中CK、0-5分别表示水、原菌液、稀释10倍菌悬液、稀释102菌悬液、稀释103菌悬液、稀释104菌悬液、稀释WXCDD51菌悬液;图7为生防细菌对番茄果实腐烂率的影响;图8为生防细菌处理对番茄果实失重率的影响;图9为生防细菌对番茄果实贮藏品质的影响;图10为生防细菌的耐旱性测定;图11为耐紫外抑菌活性测定;图12为WXCDD51的抑菌效果图,其中a-p分别表示草莓灰霉病、黄瓜褐斑病、玉米茎基腐病、葵花菌核病、水稻立枯病、刺五加根腐病、链格孢、番茄斑枯病、黄瓜炭疽病、玉米大斑病、轮枝镰刀菌、尖孢镰刀菌、西瓜枯萎病、番茄枯萎病、黄瓜枯萎病、甜瓜枯萎病;图13为WXCDD51菌悬液的平板对峙试验的抑菌效果图,其中a-l分别表示草莓灰霉病、番茄枯萎病、水稻立枯病、链格孢、葵花菌核病、番茄斑枯病、玉米大斑病、木贼镰刀菌、刺五加根腐病、玉米茎基腐病、西瓜枯萎病、轮枝镰刀菌。具体实施方式下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明,但并不局限于此,凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,均应涵盖在本发明的保护范围中。本发明提供的广谱抗病促生抗逆假单胞菌为产氮假单胞菌(Pseudomonasazotoformans)WXCDD51保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期为2016年7月12日,保藏编号为CGMCCNo.12760。一、生防细菌的筛选鉴定采用载玻片点样稀释法、平板划线分离法从植物的根际土中分离纯化得到WXCDD51菌株,再以番茄灰霉病和叶霉病为指示菌,采用双层纸环法进行筛选,即可获得生防菌株,见图1。对菌株进行形态、培养特性和生理生化特性鉴定,具体步骤如下:将生防菌WXCDD51分别在平板上划线,于30℃恒温培养48h观察单菌落特征。在显微镜下观察营养体和芽胞的形状、大小和生长情况,见图2。从葡萄糖氧化发酵试验、淀粉水解试验、接触酶试验、好氧或厌氧性试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、柠檬酸盐利用试验、甲基红反应试验、V.P.试验鉴定菌株WXCDD51的生理生化特性。对菌株进行鉴定:取2mL培养至对数期的菌液离心收集菌体,用CTAB法提取细菌基因组DNA,以基因组DNA为模板,采用通用引物进行16SrDNA进行PCR扩增,16SrDNAPCR扩增产物鉴定,利用胶回收试剂盒将含目的DNA的琼脂糖凝胶进行胶回收,将PCR回收后产物交由华大科技进行测序,把测序得到的16SrDNA基因序列在NCBI数据库中用Blast进行分析,并与已报道的序列进行同源性比对。使用MEGA5.0软件将相似度在97%以上的50株菌构建系统发育树。见图3。结果发现与其同源性较高的菌株均属于假单胞菌属(pseudomonas),由构建出的系统发育树可以看出,WXCDD51菌株与Pseudomonasazotoformans(D84009)在同一个分支上,这说明WXCDD51菌株与pseudomonasazotoformans亲缘关系最近。通过形态观察、生理生化特性鉴定和16SrDNA序列分析,将WXCDD51菌株鉴定为假单胞菌组中的pseudomonasazotoformans。二、生防细菌对番茄灰霉病菌和叶霉病菌菌丝生长的抑制作用按照2%(V/V)接种量分别将WXCDD51、对照菌X生防细菌接入于50mLPDA液体培养液中,分别接种一块直径7mm的灰霉病菌和叶霉病菌,对照组不接病菌,28℃、120r/min培养7d,用纱布过滤收集菌丝,烘干称重,每个处理3次重复。结果表明:生防菌WXCDD51对番茄灰霉病菌和叶霉病菌菌丝生长均有显著抑制作用,对灰霉病菌及叶霉病菌菌丝生长量的抑制率分别为94.9%、90.7%。见表1及图4、图5。三、生防细菌对番茄灰霉病和叶霉病的温室防效测定番茄品种为东农713,用清水浸泡后催芽,将催芽的番茄种子播种在花盆中,每盆5粒,每个处理5盆。分别喷洒新培养的灰霉病菌和叶霉病菌制成的孢子悬液于番茄叶片上。先接生防菌后接病原菌处理组:将生防菌液500倍稀释液喷施番茄叶片,1d后再分别喷洒灰霉病菌和叶霉病菌孢子。先接病原菌后接生防菌处理组:喷施病原菌1d后再喷洒生防菌500倍稀释液。各处理接种后,25℃保湿培养,在接种后15d观察发病情况。依照下列标准调查叶片受害级别,计算病情指数和防治效果。按公式(1)、(2)计算。分级方法:0级:无病斑;1级:病斑面积占整个叶面积5%以下;3级:病斑面积占整个叶面积6-10%;5级:病斑面积占整个叶面积11-20%;7级:病斑面积占整个叶面积21-40%;9级:病斑面积占整个叶面积40%以上。结果表明:先接种生防细菌后接种病原菌的防治效果灰霉病可达54.51%,叶霉病可达61.46%。先接种病原菌后接种生防菌的防治效果灰霉病可达45.27%,叶霉病可达50.61%,见表2、表3。先接种生防细菌后接种病原菌的防治效果高于先接种病原菌后接种生防菌。四、生防细菌的抑菌谱测定采用菌丝生长速率方法测定四种生防菌对16种植物病原真菌的抑菌活性,实验组取100μL菌液涂布于PDA平板上,对照组取100μL无菌水涂布于PDA平板上,在平板中心接种病原菌块(直径8mm),每个病菌3次重复,28℃培养7d,测定菌落直径,计算抑菌率。抑菌率=(对照组病菌菌落净生长量-实验组病菌菌落净生长量)/对照组病菌菌落净生长量×100%;菌落净生长量=培养7d后菌落生长直径-原菌饼直径。结果表明该菌株对16种病原真菌具有很好的抑制效果,其中对草莓灰霉病和黄瓜褐斑病的抑制作用较强,说明该菌株抑菌谱广,抑菌能力强,见表4、图12。五、生防细菌的平板对峙试验采用平板菌落对峙法测定四种生防菌对12种植物病原真菌的抑菌活性,将统一规格(外直径13mm,内直径8mm)的滤纸片放置在距离中心等距离(2cm)处,取50μL实验组菌液滴加在滤纸片上,对照组加无菌水50μL,平板中心接种病原菌块(直径8mm),每个病菌3次重复,28℃培养7d,测定病原菌菌落直径,计算抑菌率。抑菌率=(对照组病菌菌落净生长量-实验组病菌菌落净生长量)/对照组病菌菌落净生长量×100%。结果表明采用平板对峙法测定该病菌对12种病原真菌的抑制效果与采用菌丝生长速率法测定的抑制效果基本保持一致,说明该病菌抑制作用较好且稳定,见表5、图13。六、生防细菌对番茄种子的促生试验番茄种子消毒处理后,在装有10ml未稀释菌悬液、稀释10倍菌悬液、稀释102倍菌悬液、稀释103倍菌悬液、稀释104倍菌悬液、稀释51倍菌悬液和无菌水的试管中,分别放入250粒番茄种子,在上述不同浓度下浸泡3h、10h、24h后取出,将每个处理组的番茄种子整齐摆在铺有滤纸的无菌培养皿中,每个培养皿随机放入25粒番茄种子,然后分别加入3ml无菌水,置于28℃培养箱中培养,定时定量补充无菌水。每个处理组三次重复,记录发芽番茄种子的胚根长。结果表明:生防细菌WXCDD51菌悬液对番茄种子生长具有促进作用。不同浓度的WXCDD51菌悬液及不同处理时间对番茄种子胚根生长量的影响最高为CK的1.49倍,最低为CK的1.06倍,其中在稀释103倍菌悬液中浸泡3h时,胚根最长,见图6。七、生防细菌对采后番茄果实生理品质的影响测定挑选新鲜饱满、色泽鲜艳、大小成熟度一致、无机械损伤和病害的市售小番茄果实用于试验,将果实用无菌水清洗后晾干,并进行标号称重,再分别放入浓度为1×108cfu/mL的WXCDD51菌悬液中浸泡4min,取出后自然晾干,放入保鲜袋中并于室温下贮藏,以15d为贮藏周期,每隔3d对番茄果实的腐烂情况进行观察,并称重计算番茄果实的失重率。贮藏期结束时取样对果实的硬度、可溶性固形物、可滴定酸含量进行测定。试验以无菌水浸泡为对照组,每组果实30个,试验重复三次。番茄果实腐烂率调查:腐烂率的调查按公式(3)进行计算:失重率:番茄果实失重率按照公式(4)进行计算:硬度:取番茄果实最大直径处的位置削去果皮,并用调零后的GY-4果实硬度计缓慢插入果肉,记录读数。可溶性固形物:将手持折光仪用去离子水调零,将番茄果实打浆后取10g用纱布过滤挤出汁液2-3滴于折光平面,记录读数。可滴定酸含量:称取10g番茄果实置于研钵中,研磨后转移到100mL容量瓶中,再将冲洗研钵的蒸馏水,一并转入容量瓶中,再用蒸馏水定容至刻度线,摇匀。静止30min后过滤。吸取20mL滤液转入三角瓶中,加入2-3滴酸酞溶液,用标定好的NaOH溶液进行滴定,至溶液初显粉色,,并在30s内不褪色为滴定终点,记录NaOH溶液的用量。试验以蒸馏水为空白滴定,重复三次。计算公式:式中:Vc—样品提取液总体积,mL;Vs—滴定时所取滤液的体积,mL;c—NaOH滴定液的浓度,mol/LV1—滴定滤液消耗的NaOH溶液体积,mL;V0—滴定蒸馏水时所消耗NaOH溶液的体积,mL;m—样品质量,g;f—折算系数,g/mmol(番茄果实的折算系数按苹果酸进行计算,即0.067);结果表明:生防菌WXCDD51对番茄果实营养品质没有产生不良的影响。经生防细菌处理的番茄果实腐烂率约为30%,而CK对照组的腐烂率达56%,生防细菌具有较好的贮藏防腐作用,见图7。由生防细菌处理过的番茄果实失重率明显低于对照组,见图8。贮藏第15d,WXCDD51和CK对照组的硬度分别比第0d下降了28.6%和42.9%,生防细菌处理的果实相对于对照组硬度较高。贮藏结束时可溶性固形物、可滴定酸含量没有显著差别,见图9。八、生防细菌耐干旱和耐紫外的研究耐干旱:取WXCDD51单菌落转接于10mLLB液体培养基中,30℃,180r/min震荡培养24h,将培养液分别稀释10-1,然后取50μL稀释菌液至已灭好的试管中,用棉花塞塞好。放置30℃培养箱中培养,每个隔5天检测一次菌落是否有存活。重复3次。结果表明:WXCDD51菌株干旱培养30天依然有存活,见表6。利用聚乙二醇6000(PEG6000)人工模拟干旱条件。将适量的PEG加入LB液体培养基中,使最终浓度(w/v)分别为0%、5%、10%、15%、20%、25%和30%,分装于试管中,每管10ml,用脱脂棉塞封口。按照2%的接种量接种供试菌株后,至于37℃,200r/min的摇床震荡培养48h测定活菌数并测定OD600。重复3次。结果表明:在不同的人工模拟干旱条件下菌数没有太大差别。但对照组菌株不同处理条件下差别明显。说明WXCDD51菌株具有耐干旱的特性。见图10。耐紫外照射:取WXCDD51种子液2%接种于10mLLB液体培养基中,30℃,180r/min震荡培养24h,将培养液分别稀释10-1,然后取50μL稀释菌液至已灭好的载玻片上(每株菌准备18块载玻片),用涂布棒将菌液摊开,吹干后开始紫外照射,隔10min加50μL无菌水至载玻片上,搅匀,用移液器取10μL至已倒好LB的平板上,再隔10min换下一个载玻片操作同上,直至180min。重复三次。结果表明:经过10-180min不同时间段紫外线照射处理过的细菌液放置LB培养基上培养48h,均可正常生长,见表7。取WXCDD51种子液2%接种于10mLLB液体培养基中,30℃,180r/min震荡培养24h,将培养液放置在紫外灯下照射180min后采用平板稀释法测定计算活菌数,并以草莓灰霉病为指示菌,采用平板对峙法测定抑菌活性。以在自然光下,其他培养条件均相同的培养液做对照。重复3次,结果表明:紫外照射处理组菌浓度为1.27×1010cfu/mL,对照组菌浓度为1.3×1010cfu/mL,处理组和对照组菌数几乎不变;抑菌活性前后也几乎一致,见表8和图11。表1生防细菌对菌丝生长量的抑制作用表2生防细菌对番茄灰霉病温室防效表3生防菌对番茄叶霉病温室防效表4WXCDD51的抑菌谱(1.3×109cfu/mL)注:纯生长量=菌落平均直径-菌饼直径抑制率(%)=(对照组菌落纯生长量-实验组菌落纯生长量)/对照组纯生长量×100%表5WXCDD51的平板对峙试验注:原菌饼直径8mm表6菌株WXCDD51耐干旱研究结果注:“+”表示有细菌生长;“-”表示无细菌生长表7菌株WXCDD51耐紫外研究结果处理时间/minWXCDD51处理时间/min5110+100+20+110+30+120+40+130+50+140+60+150+70+160+80+170+90+180+注:“+”表示有细菌生长;“-”表示无细菌生长表8菌株WXCDD51耐紫外计数结果菌株对照组菌浓度(cfu/ml)处理组菌浓度(cfu/ml)WXCDD511.3×10101.27×1010当前第1页1 2 3 
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