本发明涉及一种核酸恒温扩增技术领域,特别涉及模板长度大于500 bp的双链DNA分子的恒温扩增技术领域。
背景技术:
1983年,Mullis等发明了聚合酶链式反应(PCR)技术,由于其在灵敏度和特异性方面的优势,被迅速运用于科学研究和临床研究的各个方面。这种技术主要依赖于与靶序列两段互补的寡核苷酸引物,利用热循环实现信号放大。反应主要包括模板高温变形、引物和模板退火、引物沿模板延伸三步反应组成一个循环,经过多次循环反应,使得低浓度的靶标可以被扩增到可检测的水平。这一技术极大地促进了生物研究的进展。
PCR技术在应用上的几点限制:第一,该技术需要昂贵的实验仪器,同时该机器需要具备精确的控温程序,以保证模板链在高温下变形,保证模板链与引物在较低温度下退火,同时重复高温、冷却、保温等步骤。为了保证仪器在短时间内完成温度变化,需要配备银制或者金制的加热模块,仪器成本显著增加。第二,扩增体系中的酶必须耐受高温,否则每次进入新循环时需要补加酶,容易造成污染。第三,在扩增反应中,退火时间短,必须有过量的引物才能使引物与模板上相应的序列快速配对。但是过量的引物会与模板错配,引发非特异性扩增,引物二聚体等问题。
1991年Compton等发明了依赖于核酸序列的扩增技术(NASBA),该技术是一种基于转录的扩增技术,反应温度为37 -41 ºC。反应涉及三种酶:T7 RNA聚合酶(对T7启动子序列具有高度特异性,以含有T7启动子序列的双链DNA为模板,合成与启动子下游的DNA互补的RNA),AMV反转录酶(以RNA为模板合成DNA,以DNA为模板合成DNA),RNase H酶(降解DNA/RNA杂合分子中的RNA链)。反应涉及两条引物:正向引物5′端是T7 启动子序列,3′端序列与靶标DNA3′端序列互补;反向引物与cDNA 的3′端序列互补。过程如下:正向引物结合到靶标DNA上,在AMV逆转录酶作用下延伸,反向引物结合到正向引物延伸后形成的DNA上,以正向引物延伸后形成的DNA为模板进行延伸,由于正向引物5′端含有T7启动子序列,因此反向引物延伸到此位置后便形成双链T7启动子。T7 RNA聚合酶识别T7启动子,并以启动子下游的DNA为模板转录合成RNA,由此,NASBA进入了循环扩增模式,得到大量RNA扩增子。
NASBA技术的特点:第一,该技术是恒温扩增反应,反应温度为37 -41 ºC,不需要使用精密的温度循环仪器。第二,扩增反应涉及AMV逆转录酶,适合RNA模板。第三,扩增的产物是单链RNA。第四,反应需要三种酶协同作用。第五,靶标长度限定在100-250个碱基。
技术实现要素:
本发明的目的在于针对长度大于500 bp的双链DNA进行恒温扩增。
本发明采用的技术方案是:
一种恒温扩增反应试剂,溶剂为水,其组成如下:
上述反应试剂所用的Tris–HCl的pH为8.5。
进一步的,本发明还提出一种连接反应试剂,溶剂为水,其组成如下:
上述反应试剂所用的Tris–HCl的pH为7.9。
上述连接反应将T7序列与剪切后的模板连接。
本发明又提出一种长双链模板的剪切方法,包括根据序列选择限制性内切酶对模板剪切,不同的限制性内切酶采用不用的缓冲液体系,剪切后将体系的酶灭活,完成剪切反应。
恒温扩增反应结束后用凝胶电泳对反应产物进行检测。
恒温扩增引物需要根据不同的序列进行不同的设计。
一种核酸恒温扩增方法,包括将引物、模板与扩增反应试剂混合,恒温扩增至预期量后,完成恒温扩增。
作为上述反应试剂的进一步改进,恒温扩增的温度为37 -41 ºC。
本发明的有益效果是:
本发明的恒温扩增靶标针对长度大于500 bp的双链DNA,甚至于长度大于2000 bp的双链DNA,应用范围广。
附图说明
图1是实施例1的恒温扩增结果;泳道1:模板浓度20 nM的反应产物;泳道2:模板浓度10 nM的反应
产物;泳道3:模板浓度1 nM的反应产物;泳道4:阴性对照;
M:20 bp DNA Ladder Marker。
图2是实施例2的恒温扩增结果;泳道1:含有模板的反应组;泳道2:阴性对照。
具体实施方式
一种恒温扩增反应试剂,溶剂为水,其组成如下:
上述反应试剂所用的Tris–HCl的pH为8.5。
上述反应试剂三羟甲基氨基甲烷(Tris)购于捷瑞(上海)生物科技公司。
上述反应试剂氯化钾(KCl)、氯化镁(MgCl2)、盐酸(HCl)购于上海林峰精细化工有限公司。
上述反应试剂二甲基亚砜(DMSO)购于Sigma-Aldrich公司(Saint Louis,美国)。
上述反应试剂T7 RNA 聚合酶、AMV反转录酶、RNase H酶、牛血清白蛋白(BSA)购于纽英伦生物技术公司(Nebraska,美国)。
上述反应试剂核糖核苷酸(NTP)、RNA酶抑制剂(RNase inhibitor)购于赛默飞世尔科技有限公司(北京,中国)。
上述反应试剂脱氧核糖核苷酸(dNTP)购于生工公司(上海,中国)。
一种连接反应试剂,溶剂为水,其组成如下:
上述反应试剂所用的Tris–HCl的pH为7.9。
上述反应试剂购于宝生物工程有限公司(大连,中国)。
扩增反应引物的设计依据为靶标模板的序列。
Tris–HCl的作用在于维持一定的pH,以便酶在最适pH下进行扩增反应,其浓度可以根据需要进行相应的调整。
KCl的作用在于提供一定的例子浓度,其用量可以根据核酸扩增情况进行一定的调整。
T7 RNA聚合酶、AMV逆转录酶、RNase H酶的用量可以根据需要调整。
恒温扩增反应后可以用凝胶电泳对反应产物进行检测。
一种核酸恒温扩增方法,包括将引物、模板与扩增反应试剂混合,恒温扩增至预期量后,完成恒温扩增。
作为上述反应试剂的进一步改进,恒温扩增的温度为37 -41 ºC。
下面结合实施例,进一步说明本发明的技术方案。
实施例1:
一种长双链DNA的剪切反应试剂的具体成分如下:
上述反应试剂购于宝生物工程有限公司(大连,中国)。
一种连接反应试剂,溶剂为水,其组成如下:
上述反应试剂购于宝生物工程有限公司(大连,中国)。
一种恒温扩增反应试剂,溶剂为水,其组成如下:
上述反应试剂三羟甲基氨基甲烷(Tris)购于捷瑞(上海)生物科技公司。
上述反应试剂氯化钾(KCl)、氯化镁(MgCl2)、盐酸(HCl)购于上海林峰精细化工有限公司。
上述反应试剂二甲基亚砜(DMSO)购于Sigma-Aldrich公司(Saint Louis,美国)。
上述反应试剂T7 RNA 聚合酶、AMV反转录酶、RNase H酶、牛血清白蛋白(BSA)购于纽英伦生物技术公司(Nebraska,美国)。
上述反应试剂核糖核苷酸(NTP)、RNA酶抑制剂(RNase inhibitor)购于赛默飞世尔科技有限公司(北京,中国)。
上述反应试剂脱氧核糖核苷酸(dNTP)购于生工公司(上海,中国)。
实施例2
同实施例1,不同之处在于长双链DNA的剪切反应试剂,具体成分如下:
上述反应试剂购于宝生物工程有限公司(大连,中国)。
下面结合具体的实验,进一步说明本发明。
鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株的invA基因的恒温扩增
正向引物:GATCACTAATACGACTCACTATAGGGAATAGAGAAGACAAC
AAAACCCACC
反向引物:GCCGATGCCGGTGAAATTATCG
正向T7序列:CGTTCTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTT
GAGGGGTTTTTTGGATCACTAATACGACTCACTATAGGGC
反向T7序列:CATGGCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATCCAAAAAAC
CCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGAA
本实施例用鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株的invA基因作为样本,用无菌双蒸水作为阴性对照,在反应管中加入不同浓度的基因样本,同时进行恒温扩增反应。37 ºC反应60 min后取出反应管。取出9 μL反应液混合1μL 10 x Loading buffer后进行电泳,电泳结果显示84 bp处有条带,阴性对照则没有。(结果见附图1)
质粒pET28a上随机500 bp序列的扩增
正向引物:GATCACTAATACGACTCACTATAGGGACGCGTCAGTGGGCT
GATCATTAAC
反向引物:GCGCGATTTGCTGGTGACCCAAT
正向T7序列:ATCCTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGA
GGGGTTTTTTGGATCACTAATACGACTCACTATAGGGA
反向T7序列:CGCGTCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATCCAAAAAACC
CCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGGAT
本实施例用pET28a上随机500 bp序列作为样本,为阳性组,用无菌双蒸水作为阴性对照,同时进行恒温扩增反应。37 ºC反应60 min后取出反应管。取出9 μL反应液混合1μL 10 x Loading buffer后进行电泳,电泳结果显示200 bp处有条带,阴性对照则没有。(结果见附图2)。