制备紫杉醇的方法与流程

本发明涉及制备紫杉醇的方法。

背景技术：

1963年美国科学家首次从一种太平洋杉树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物，并发现其对鼠肿瘤细胞有很高活性。后来通过ⅱ-ⅲ临床研究，紫杉醇被广泛应用于卵巢癌和乳腺癌等癌症的治疗，是现在最有潜能且商业应用最为成熟的一种抗癌药。但随着逐年的砍伐以及生长速度的缓慢，可利用的红豆杉已经越来越少，使得红豆杉的供需失衡问题日趋严重，难以实现可持续商业化生产。现今主要通过化学半合成法生产紫杉醇：通过从红豆杉叶片等组织中提取中间产物如巴卡亭iii、10-去乙酰基巴卡亭ⅲ等，随后通过化学合成生产紫杉醇，但该方法仍然没有摆脱对红豆杉的依赖，因而价格一直居高不下。

利用微生物发酵生产人类所需目标化合物现今已经取得了可喜成果，因而也有很多科学家立志于寻找能产生紫杉醇的微生物来高效生产紫杉醇。自1993年stierle等人发现了第一株能够产紫杉醇的真菌以来，人们已发现并报道了多个种属的真菌具有合成紫杉醇的能力。然而由于检测手段的缺陷以及代谢不稳定的问题则使得其难以被用于商业化生产。

因而，目前的利用真菌发酵产紫杉醇的方法仍有待进一步研究。

技术实现要素：

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种代谢稳定、产率较高的利用真菌发酵产紫杉醇的手段。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现和工作而完成的：

目前常用的测定紫杉醇的方法有液相色谱法和低分辨质谱法。但是，在液相色谱检测中，仅仅依靠出峰时间的一致是难以鉴定某一种化合物。由于真菌产紫杉醇的含量很低，以及发酵液提取物成分较为复杂。而针对复杂基质中微量成分的分析，低分辨质谱难以正确的将紫杉醇和杂质区分开来，所以也会引起误判紫杉醇的真实存在。但是本发明通过采用液相色谱-离子阱静电场轨道阱质谱联用技术(hplc-ltqorbitrap)建立了一套灵敏度强，准确性高的紫杉醇鉴定方法，检测并验证了真菌交链格孢(alternariaalternatatpf6)能够产生紫杉醇。

进一步，基于检测手段的进步，发明人针对微生物发酵生产紫杉醇进行了一系列深入的研究。由于紫杉醇产生菌tpf6为植物内生真菌，其对外界环境要求较为苛刻，存在着次级代谢不稳定的内生菌共性问题，严重影响着真菌产紫杉醇这一方向的科学研究及工业化应用。而通过多次的试验探索，发明人首次开发了基于细菌及丝状真菌共培养的方法，将紫杉醇产生菌(例如交链格孢)与产紫杉二烯的大肠杆菌工程菌株共培养，实现了紫杉醇的较为稳定的生产。本发明利用细菌和真菌共培养方式实现紫杉醇较为稳定的生产，为后续进一步利用微生物产生紫杉醇提供了强有力的保障。同时也为内生菌次级代谢不稳定这一共性问题提出了有效的解决方法，具有广阔的应用前景。

另外，由于以ggpp为底物的紫杉醇生物合成途径涉及19个酶促反应步骤，其中包含着紫杉二烯合酶以及一系列细胞色素p450羟化酶等限速步骤，这极大地限制了紫杉醇的高效生物合成。本发明通过对交链格孢体内涉及前体物质ggpp合成的mva途径中的关键基因以及紫杉醇生物合成第一步所需的紫杉二烯合酶进行过表达，成功地在交链格孢体内实现了紫杉二烯的积累，为后续代谢中间产物的积累提供尽可能多的前体物质。

从而，发明人通过对交链格孢进行一系列代谢工程改造实现了紫杉醇生物合成前体物质紫杉二烯的积累，使得紫杉二烯产量达到61.91±6.32μg/l，为紫杉醇的生物合成提供尽可能多的底物。同时，为了增强其底物的供给，发明人还在大肠杆菌体内通过定向代谢工程实现了基于甲羟戊酸途径生产紫杉二烯。进而，通过将经过基因改造的紫杉醇产生菌和产紫杉二烯的大肠杆菌共培养，紫杉醇的产率可以有效提高。

由此，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备紫杉醇的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将产紫杉醇的真菌与大肠杆菌共培养，以便获得共培养产物，所述共培养产物即包含紫杉醇。

发明人惊奇地发现，相对于将紫杉醇产生真菌单独培养生产紫杉醇的方法，采用本发明的方法生产紫杉醇，代谢不稳定性得到了很大的改善，发酵产物紫杉醇能够相对容易地检测到。也即，利用本发明的方法能够有效地生产紫杉醇，且代谢稳定，产率较高，有很好的推广价值，有利于推进紫杉醇稳定生物合成研究。

其中，需要说明的是，产紫杉醇的真菌并不受特别限制，任何紫杉醇产生菌均适用本发明。根据本发明的一些具体示例，所述产紫杉醇的真菌为选自交链格孢和hqd33的至少之一。

根据本发明的实施例，所述产紫杉醇的真菌能够过表达选自甲羟戊酸途径中的关键基因和紫杉二烯合成的相关基因的至少之一，优选紫杉二烯合酶ts基因、香叶基香叶基焦磷酸合酶ggpps基因和idi基因的至少之一。其中，甲羟戊酸途径生成紫杉醇合成的前体物质香叶基香叶基焦磷酸(ggpp)。由此，能够在产紫杉醇的真菌中实现前体物质ggpp和紫杉二烯的积累，为后续代谢中间产物的积累提供尽可能多的前体物质，以便有效提高紫杉醇的产率。

其中，需要说明的是，所述甲羟戊酸(mva)途径的相关基因包括：(1)将乙酰辅酶a缩合为乙酰乙酰辅酶a的基因atob或其功能等同体；(2)将乙酰辅酶a和乙酰乙酰辅酶a缩合为hmg-coa的基因erg13或其功能等同体；(3)将hmg-coa还原为甲羟戊酸的基因thmg1或其功能等同体；(4)将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸-5-磷酸的基因erg12或其功能等同体；(5)将甲羟戊酸-5-磷酸磷酸化为甲羟戊酸-5-焦磷酸的基因erg8或其功能等同体；(6)将甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧生成异戊烯焦磷酸的基因mvd1或其功能等同体；(7)将异戊烯焦磷酸异构为二甲基烯丙基焦磷酸的基因idi或其功能等同体。

所述紫杉二烯合成的相关基因包括：(1)将异戊二烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸缩合为牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸的基因牻牛儿基牻牛儿基的焦磷酸合酶ggpps基因或其功能等同体；(2)将牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸环化为紫杉二烯的紫杉二烯合酶ts基因或其功能等同体。

另外，产紫杉二烯的大肠杆菌的菌株种类也不受特别限制。根据本发明的一些实施例，所述大肠杆菌为e.colit2。

根据本发明的实施例，所述大肠杆菌能够过表达紫杉二烯合成的相关基因，优选atob、idi、erg8、mvd1、erg13、erg12和thmg1基因中的至少之一。由此，由此，能够在大肠杆菌中实现紫杉二烯的积累，以便为产紫杉醇的真菌生产紫杉醇提供尽可能多的前体物质，提供强有力的保障，从而能够提高大肠杆菌和紫杉醇产生菌的共培养生产紫杉醇的稳定性和产率。

根据本发明的实施例，在所述共培养中，所述产紫杉醇的真菌与所述大肠杆菌的体积比为5-15：1，优选10：1。

根据本发明的实施例，采用pd液体培养基，在28℃、250rpm的条件下，进行所述共培养10-20天，优选18天。由此，共培养效果好，紫杉醇产率高。

根据本发明的实施例，在进行所述共培养之前，进一步包括：分别将所述产紫杉醇的真菌和所述大肠杆菌进行发酵。由此，共培养效果好，紫杉醇产率高。

根据本发明的一些具体示例，将所述产紫杉醇的真菌进行发酵包括：

将所述产紫杉醇的真菌接种于pda培养基上，待其长满平板后接种于pd液体培养基中，于28℃，250rpm条件下培养3天；

按照1％接种量，将菌种再次转接于pd液体培养基中，于28℃，250rpm条件下培养3天；

按照3％接种量，将经过培养的菌种转接于新的pd液体培养基中，于28℃，250rpm条件下培养12天。

根据本发明的另一些实施例，当所述所述大肠杆菌经过基因改造，能够过表达紫杉二烯合成的相关基因时，将所述大肠杆菌进行发酵包括：

挑取所述大肠杆菌的单菌落到含2％甘油的lb培养基中，于30℃，220rpm条件下过夜培养；

按照1％接种量，将经过过夜培养的菌种接种到新鲜的含2％甘油的lb培养基中，于30℃，220rpm的条件下继续培养至od600约为0.6～0.8时，加入终浓度为0.1mm的iptg进行诱导表达培养12小时。

根据本发明的实施例，该方法进一步包括：将所述共培养产物依次进行离心、萃取，以便获得紫杉醇。由此，所得紫杉醇纯度高。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了实施例1中，真菌发酵产紫杉醇的lc-ms分析结果，其中，

图1a为tpf6发酵产物以及标准品按紫杉醇分子量提取的[m+h]⁺离子流，

图1b为一级质谱结果，tpf6发酵产物以及紫杉醇标准品提取的紫杉醇[m+h]⁺母离子碎片，

图1c为二级质谱结果，tpf6发酵产物以及紫杉醇标准品的二级子离子碎片；

图2显示了实施例2中，e.colit2和tpf6共培养发酵产紫杉醇的lc-ms分析结果，其中，

图2a为共培养示意图，

图2b为一级质谱结果和二级质谱结果，共培养后通过提取紫杉醇检测紫杉醇[m+h]⁺离子流，[m+h]⁺母离子碎片以及二级子离子碎片检测紫杉醇；以及

图3显示了实施例3中，hqd33及其与e.colit2共培养发酵产紫杉醇，如图3所示，从上至下依次为紫杉醇标准品、hqd33发酵产物以及hqd33与e.colit2共培养发酵产物；从左至右依次为根据紫杉醇分子量提取的[m+h]⁺离子流，紫杉醇[m+h]⁺离子的同位素峰以及母离子为[m+h]⁺离子的二级碎片；离子峰。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1真菌tpf6发酵产紫杉醇

将从-80℃20％甘油保藏的交链格孢(alternariaalternatatpf6)接种于pda培养基(土豆200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l)上，待其长满平板后接种于pd液体培养基(土豆200g/l，葡萄糖20g/l)(100/250ml)中28℃，250rpm培养，培养3天后1％接种量再次转接于pd液体培养基(100/250ml)中28℃，250rpm培养14天后停止发酵。离心分别收集菌体及发酵液，发酵液用等体积的二氯甲烷萃取3次，38℃减压浓缩蒸干，最后用1.5ml甲醇复溶。菌体加入蒸馏水后粉碎机粉碎，萃取方法同发酵液，萃取4次，最后用1.5ml甲醇复溶。

使用thermofisherscientific公司的ltq-orbitrapxl高分辨质谱检测紫杉醇的合成。lc-ms检测条件：thermofisherscientificaccela液相色谱系统；色谱柱：hypersilgold-c18100×2.1mm，3um(thermofisherscientific公司)；流动相：a为含0.1％甲酸的蒸馏水，b为含0.1％甲酸的乙腈；流速为200μl/min，洗脱程序为以水-乙腈(55/45，v/v)等度洗脱15min，样品盘温度为25℃，柱温25℃，进样量为10μl。质谱条件：电喷雾离子源正离子模式检测，离子源温度为45℃，鞘气流速为30arb，辅助气为8arb，喷雾电压为4.5kv，毛细管温度为300℃，毛细管电压为25.5v，透镜为125。一级质谱全扫描用静电场轨道阱分析器，分辨率设置为fwmh60,000，扫描范围为m/z200–1000，二级质谱用线性离子阱分析器普通模式，离子阱中碰撞气为氦气，碰撞模式为能量诱导裂解cid，二级母离子为854.34([m+h]⁺)时，隔离宽度设为3，碰撞能量为20，激活q值为0.15，激活时间为30ms，扫描范围为235-900；

经lc-ms保留时间(图1a)，一级质谱(图1b)和二级质谱(图1c)数据显示，在20次的发酵产物中我们成功地检测到了2个发酵组能够合成紫杉醇，其产量为1-2μg/l。

实施例2e.colit2与真菌tpf6共培养产生紫杉醇

将从-80℃20％甘油保藏的菌种tpf6接种于pda培养基上，待其长满平板后接种于pd液体培养基(100/250ml)中28℃，250rpm培养，培养3天后1％接种量再次转接于pd液体培养基(100/250ml)中28℃，250rpm培养，三天后按3％接种量接种于pd液体培养基(100/500ml)28℃，250rpm培养(共计5瓶)。

挑取10个e.colit2菌株(即过表达3个质粒pmh1、pfz81、pxc02的菌株，其制备方法可参见中国专利申请cn201310595448.8的说明书中的描述，通过参照将其全文并入本文)的单菌落到lb培养基中(添加有100μg/ml氨苄青霉素，50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素，因为本实施例采用的上述t2菌株同时具有这3种抗性，添加相应的3种抗生素能够防止杂菌污染)，于30℃，220rpm过夜培养，随后按1％接种量接种到新鲜的lb培养基中30℃，220rpm继续培养至od600约为0.6～0.8小时，加入终浓度为0.1mm的iptg进行诱导表达(iptg可以与lac操纵子中的阻遏蛋白结合从而诱导lac操纵子实现蛋白的大量表达)。

然后，向发酵了12天的tpf6培养物中加入1/10发酵体积的诱导了20h后的e.colit2菌株，从而为tpf6提供mva途径代谢产物，香叶基香叶基焦磷酸(ggpp)以及紫杉二烯等代谢中间产物以利于紫杉醇的合成。tpf6与e.colit2在28℃，250rpm条件下共培养至18天停止发酵。产物萃取参照实施例1。

经lc-ms保留时间，一级质谱和二级质谱数据显示(图2)，在3次的共培养实验结果中，我们成功地在t2与真菌tpf6共培养实验组中检测到了紫杉醇，其含量为0.805ug/l。较之前的真菌单独培养产紫杉醇，其产量无明显变化，代谢不稳定性得到了很大的改善，使得我们能够相对容易地发酵检测到紫杉醇，推进了紫杉醇稳定生物合成研究。

实施例3e.colit2与真菌hqd33共培养产生紫杉醇

分别按实施例1以及实施例2所述的方法对另外一株文献报道的产紫杉醇真菌树状多节孢(nodulisporiumsylviformehqd33)进行发酵，以及利用改造的产紫杉二烯的e.colit2与hqd33共培养发酵，并lc-ms分析紫杉醇的合成(图3)。

利用传统方法发酵20次我们仍没有在hqd33发酵产物中检测到紫杉醇的合成；利用共培养方法对hqd33进行发酵3次后，我们在其中1次hqd33共培养发酵产物中检测到了紫杉醇。该结果与实施例1以及实施例2的结果相吻合，说明通过共培养方法为紫杉醇生物合成途径提供前体物质可以在一定程度上减轻其代谢不稳定的情况，为微生物体内其它代谢不稳定产物的稳定生物合成提供了有益的指导。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。