一种T1R3基因过表达慢病毒载体、慢病毒及其构建方法与流程

文档序号:12457380阅读:619来源:国知局
一种T1R3基因过表达慢病毒载体、慢病毒及其构建方法与流程
本发明属于分子生物学
技术领域
,具体涉及一种T1R3基因过表达慢病毒载体、T1R3慢病毒及其构建方法。
背景技术
:味觉功能学研究表明,甜味主要由味觉细胞的G蛋白偶联受体(Gproteincoupledreceptors,GPCRs)家族所介导,即味觉受体第1家族(tastereceptorfamily1members,T1Rs)。其中T1R2和T1R3是甜味受体,它们以T1R2+T1R3异二聚体的形式发挥作用,共同对甜味进行识别。甜味受体在结合配体后,下游G蛋白被激活,其α亚基与β、γ亚基分离,Gα亚基进入胞浆进而激活下游效应器,最终导致细胞内钙离子浓度升高。因此,通过构建共表达T1R2、T1R3和Gα基因的细胞系,可用钙流检测方法对甜味物质进行识别。构建共表达人T1R2、T1R3和Gα基因的细胞系,需要使用到带有人T1R3基因的过表达载体。现有的方法采用的是将整合有T1R3基因的质粒载体通过脂质体对宿主细胞进行转染,但是脂质体转染质粒载体的转染效率较低,要构建能稳定共表达T1R2、T1R3和Gα三种基因的细胞系成功率也较低。因此,如何提高T1R3基因过表达载体的转染效率是目前亟需解决的问题。技术实现要素:本发明的目的是为了解决现有技术的不足,提供一种T1R3基因过表达慢病毒载体、T1R3慢病毒及其构建方法,该方法所构建的慢病毒载体,转染效率高,并能将T1R3基因整合到宿主细胞的基因组中,因此能特异、持续、高效地促进T1R3基因在宿主细胞中的稳定表达。为实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:一种T1R3基因过表达慢病毒载体,以慢病毒pLVX-Puro慢病毒表达载体为基础进行构建,并整合有T1R3基因,得到T1R3基因过表达慢病毒载体pLVX-Puro-T1R3。本发明还提供pLVX-Puro-T1R3慢病毒表达载体的构建方法,包括如下步骤:步骤(1),人工合成T1R3基因;步骤(2),以下列PCR扩增引物进行T1R3基因的PCR扩增:所述的PCR扩增引物为:T1R3-F:agattctagagctagcaccaccatggatgctgggccctgctg;T1R3-R:agatccttgcggccgctcactcatgtttcccctg;步骤(3),用限制性内切酶EcoRI和BamHI分别对T1R3基因的PCR产物和慢病毒载体pLVX-Puro进行双酶切;步骤(4),用T4DNA连接酶将酶切的得到的线性化的T1R3基因和慢病毒载体连接,将得到的连接液转化DH5α感受态细胞,并进行PCR鉴定,对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对,比对正确的克隆即为构建成功的T1R3基因过表达慢病毒载体pLVX-Puro-T1R3;其中,步骤(4)PCR鉴定采用的PCR扩增引物与步骤(2)所采用的PCR扩增引物相同。步骤(4)测序所用引物为:CMV-F:cgcaaatgggcggtaggcgtg;PGK:cattctgcacgcttcaaaag;T1R3seq1:accttcccctccttcttc;T1R3seq2:ctctgtctacgcagctgtg。本发明另外提供一种T1R3慢病毒的构建方法,采用上述T1R3基因过表达慢病毒载体,方法是:使用慢病毒包装质粒pRSV-Rev、pMDlg-pRRE和pMD2.G对T1R3基因过表达慢病毒载体pLVX-Puro-T1R3进行包装。,通过转染HEK293细胞,得到T1R3慢病毒。本发明还要求保护上述T1R3慢病毒的构建方法构建得到的T1R3慢病毒。本发明与现有技术相比,其有益效果为:本发明所构建的T1R3基因过表达慢病毒载体对宿主细胞的转染效率高达80%~90%,比起现有的质粒转染法转染效率提高了1倍以上。此外由于慢病毒能将T1R3基因整合到宿主细胞的基因组中,因此使用该方法能特异、持续、高效地促进基因T1R3在宿主细胞中的稳定表达。过表达T1R3基因的细胞可用于构建共表达T1R2、T1R3和Gα基因的细胞系,可用钙流检测方法对甜味物质进行识别。附图说明图1是pLVX-Puro慢病毒表达载体图谱;图2是pRSV-Rev慢病毒包装质粒图谱;图3是pMDlg-pRRE慢病毒包装质粒图谱;图4是pMD2.G慢病毒包装质粒图谱。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过购买获得的常规产品。主要实验试剂及厂家:大肠杆菌菌株DH5α(Invitrogen)胎牛血清FBS(Invitrogen)胰蛋白酶(Invitrogen)DMEM完全培养基(含10%FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)(Invitrogen)限制性内切酶(Fermentas)T4DNA连接酶(NEB公司)质粒DNA提取试剂盒(Axygen公司)制备感受态试剂盒(BIOSCIENCES)PrimeSTARMaxPremix(2X)(Takara)逆转录酶MuLV(NEB)RNAnase抑制剂(NEB)SYBRGreenqPCRMasterMix(2X)(ThermoScientific)pLVX-Puro、pRSV-Rev、pMDlg-pRRE和pMD2.G,均可商购于上海比昂生物医药科技有限公司。实施例1:T1R3基因过表达慢病毒载体构建。1、人工合成T1R3基因,其DNA如SEQIDNO.1所示。2、使用PrimeSTAR高保真酶,以人工合成的T1R3基因为模板,通过如表1所示引物进行的PCR扩增:表1PCR反应体系与条件如表2:表2试剂体积模板1μL上游引物T1R3-F(10μM)1μL下游引物T1R3-R(10μM)1μLPrimeSTARMax(2x)10μLddH2O7μL总体积20μLPCR程序如表3:表33、琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物大小是否与预期一致,切割在琼脂糖凝胶电泳胶中的目的片段条带,用DNA回收试剂盒回收纯化;4、用EcoRI和BamHI限制性内切酶分别对T1R3基因的PCR产物和慢病毒表达载体pLVX-Puro进行双酶切(于37℃酶切3h),反应体系和反应条件如表4:表45、琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果,切割在琼脂糖凝胶电泳胶中的T1R3基因片段条带和线性化的慢病毒载体,用胶回收试剂盒回收DNA;6、用T4DNA连接酶于16℃水浴下,将两种酶切产物进行连接,过夜。反应如表5:表5试剂体积10XT4DNA连接酶buffer2μLT4DNA连接酶(400U/μL)1μLT1R3基因片段10μL线性化的慢病毒表达载体4μLddH2O3μL总体积20μL7、转化感受态细胞:从-80℃冰箱取出1管100μLDH5α感受态细胞,放冰上解冻(解冻至无冰状态)后取10μL上述步骤6中的连接产物加到感受态细胞中混匀,静置30min,42℃水浴热激1min,冰上静置2min。加LB液体培养基500μL,37℃振荡培养1小时。3000rpm离心5min,留100μl左右上清液混匀细菌后涂到LB平板上,37℃倒置培养过夜。8、挑取数个菌落,做菌落PCR检测转化子,反应体系和条件见步骤2;9、将菌落PCR鉴定得到的阳性克隆进行测序验证,测序引物如表6:表6引物序列引物序列(5’-3’)SEQIDNO.CMV-Fcgcaaatgggcggtaggcgtg4PGKcattctgcacgcttcaaaag5T1R3seq1accttcccctccttcttc6T1R3seq2ctctgtctacgcagctgtg7实施例2:T1R3慢病毒包装1、用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK293细胞,细胞密度为5×106时;重新接种于含有25mL含10%(v/v)FBS的无抗生素DMEM培养基直径为15cm的细胞培养皿中,37℃,50mL/LCO2培养箱内培养;2、制备慢病毒包装系统中四种质粒DNA溶液:将以上质粒加入无菌水定容至1800μL,再加入CaCl2(2.5mol/L)溶液200μL,混匀,加入2×PBS缓冲盐溶液2000μL,室温放置20~30min;3、当细胞密度达60%~70%时进行转染。此时将步骤2中制备的DNA溶液和磷酸钙混合液转移至步骤1得到的含单层细胞的细胞培养皿中,混匀,培养12h后弃去培养液,细胞用15mLPBS溶液冲洗,共洗3次。4、向上述细胞培养皿中加入含100mL/LFBS的DMEM细胞培养液15mL,继续培养48h;5、收集转染72h的HEK293细胞上清液;6、将收集的上清液于4℃,4000g离心10min,再次收集上清液;7、将再次收集得到的上清液以0.45μm滤器过滤;8、将滤液于40mL超速离心管中,4℃,25000r/min离心20min,弃上清液;9、而后以冰500ulPBS重旋病毒沉淀于4℃溶解过夜,得到慢病毒液,即T1R3慢病毒。实施例3:细胞转染和筛选1、在6孔细胞培养板中培养HEK293细胞,待细胞完全贴壁汇合度为40%-50%后,即可进行细胞转染;转染前,每孔细胞换成500μL新鲜的DMEM完全培养基,并且每孔加入1μL的聚凝胺(polybrene),放置于培养箱孵育1h。2、在上述6孔细胞培养板的2个孔中,分别加入5μL实施例2得到的T1R3慢病毒液,其中一孔细胞加10μL的空载慢病毒液(空载慢病毒液与T1R3慢病毒液的唯一区别是不含有T1R3基因,其余制备方法都相同),另一孔做空白细胞对照,充分的摇匀后放入37℃、5%(v/v)CO2、95%相对湿度的培养箱中培养3、转染6小时后,吸走孔内的培养基,并用PBS洗两次;换成新鲜的DMEM完全培养基,放入37℃、5%(v/v)CO2、95%相对湿度的培养箱中培养。4、待细胞生长至80%融合度时,加入3μL的嘌呤霉素Puromycin(2mg/mL)进行药筛(Puromycin的终浓度为3ug/ml);5、第二天观察到细胞多数漂浮,去除前一天药筛的漂浮细胞,待细胞贴壁加入3μL的Puromycin(2mg/mL)维持;6、加药后细胞多漂浮,每天更换完全培养基和3μL的Puromycin(2mg/mL)直至空白细胞HEK293全部凋亡后,给纯化后的HEK293-T1R3换上新鲜的完全培养基继续培养;7、筛选得到纯化的HEK293-T1R3细胞更换上新鲜的完全培养基继续进行传代扩大培养,每次更换细胞培养基均需要加入原药物浓的一半来维持细胞生长,即Puromycin的终浓度为1.5ug/ml。实施例4:使用实时荧光定量PCR进行T1R3基因的表达检测。1、HEK293-T1R3细胞总RNA提取:1)将10cm细胞培养皿中汇合度达80%的筛选得到的HEK293-T1R3细胞用预冷PBS缓冲液洗2遍,加1mlTrizol裂解液重悬。2)接着加入0.2ml三氯甲烷,剧烈摇动10s,室温放置3分钟。3)4℃,12000rpm离心20min。4)将上清水相转移至另一新的无RNA酶离心管中,并加入等体积的异丙醇,混匀,-80℃放置1h。5)4℃,12000rpm离心10min,去上清。6)加入1ml体积浓度为75%乙醇洗涤沉淀。7)4℃,5000rpm离心3min,去上清,室温晾干。9)加入40μLRNA-free水溶解RNA。2、去基因组DNA和cDNA的合成将RNA加入到gDNA吸附柱,室温10,000g离心1min,收集滤液即为去除基因组DNA的RNA。cDNA合成条件:RNA1μgdNTP(10mM)1μloligodT(40μM)1μl随机引物(40μM)1μl加RNase-free水至34.5μl;至于75℃5min,冰上5min。向上述反应后的溶液中添加反转录试剂:MuLV1μl10Xbuffer4μlRNAnase抑制剂0.5ul42℃反应1h,75℃灭活酶10min,备用3、cDNA的实时荧光定量PCR将T1R3基因和内参基因actin的cDNA样本分别取样在荧光定量PCR仪上进行反应,每个样本设置3个平行实验。PCR反应体系为20μL,反应体系如表7:表7荧光定量PCR使用的引物如表8:表8反应条件为:循环结束后从60℃升高到98℃获取熔解曲线。本发明所构建的T1R3基因过表达慢病毒载体对宿主细胞的转染效率高达80%~90%。实验以actin为内参基因,采用2-△ΔCt法进行分析,经所构建的pLVX-Puro-T1R3慢病毒载体转染的HEK293细胞中T1R3基因的相对表达量是未转入T1R3基因的HEK293细胞的2.62倍。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。序列表当前第1页1 2 3 
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