维生素D结合肽及其应用的制作方法

本发明涉及一种多肽，特别涉及一种维生素D结合肽及其应用。

背景技术：

维生素D是一种由长的碳氢链或稠环组成的脂溶性维生素，是类固醇衍生物。它促进正常骨骼的形成，增强小肠和肾脏对钙、磷、铁和锌离子的吸收，并且能够调节包括骨骼和心脏在内的所有肌肉的健康、免疫反应、血糖和体内胰岛素的水平。对于人类来说，与身体健康状况密切相关的最重要的两种维生素D的形式是维生素D2和维生素D3，又分别称作麦角钙化醇和胆钙化醇^[1]。麦角钙化醇和胆钙化醇能够从饮食和补充剂摄取^[1][2][3]，但很少的食物含有天然的钙化醇和胆钙化醇。事实上，无论成年人有多充足的营养，他们都不可能从饮食本身获得足够的维生素D。因此，维生素是在紫外线的照射下，通过皮肤的光化学作用合成的。维生素D3是在皮肤的基底层，7-脱氢胆固醇吸收紫外线的B光子，生成维生素D3的前体，随后经历一个与温度变化有关的三烯结构的重排形成维生素D3、光甾醇和速固醇（Fig.1.1）^[4][5][6]。在2004年迈克尔指出，维生素D3的合成受季节、生活所在地的纬度、种族、年龄、皮肤色素的沉着和其他的因素。

维生素D对人的身体健康非常重要。维生素D激素性的作用包括监管骨骼和肌肉的健康，调节免疫反应，调节胰岛素和血糖，,调节钙、磷分解代谢。所以，维生素D缺乏是威胁人类健康的一个重大问题。测量血清25羟基维生素D (25(OH)D) 的浓度是确定维生素D状态最好的测试方法。体内25(OH)D的水平分段如下^[14]：

维生素D不足：21-29 ng/mL (52.5-72.5 mmol/L)

维生素D缺乏：< 20 ng/mL (< 50 mmol/L)

虽然对维生素D不足的诊断并不总是必需的，但其在一定程度上反映人体的健康状况。血清甲状旁腺激素水平的测定可能有助于确立维生素D不足的诊断，如维生素D不足的患者往往有甲状旁腺激素水平的升高，提示继发性甲状旁腺功能亢进。

维生素D缺乏已被证明几乎在每一个重大疾病中发挥一定作用。这包括:骨质疏松症和骨量减少,17个类型的癌症(包括乳腺癌、前列腺癌和结肠癌)、心脏病、高血压、肥胖、代谢综合征、糖尿病、自身免疫性疾病、多发性硬化症、风湿性关节炎、骨关节炎、黏液囊炎、痛风、不孕和经前综合症,帕金森氏症、抑郁症和季节性情绪失调,阿尔茨海默氏症、慢性疲劳综合症、纤维肌痛、慢性疼痛、牙周疾病,牛皮癣等。接下来详细介绍维生素D缺乏与这些疾病发生的密切关系。

在骨骼系统中，骨骼、肠道和肾脏中存在很多维生素D的特异性受体，能够发挥其骨骼生物效应，促进钙的吸收利用。1, 25 （OH）₂VD3调节甲状旁腺激素（PTH）和成纤维细胞生长因子23（FGF23）的分泌，对维持体内正常骨矿平衡和骨的形成起重要的作用。如果成年人体内VD缺乏，就会引起骨软化症，老年人维生素D缺乏就会发生骨质疏松，而其发生在婴幼儿体内时，就会出现佝偻病。而且维生素D缺乏还会引起肌肉无力，增加骨折和跌倒的风险等严重后果。

在免疫系统方面，1, 25 （OH）₂VD3可抑制淋巴细胞增殖及免疫球蛋白的产生，延缓B淋巴细胞活化成浆细胞的过程，对自身免疫性疾病具有益处，还能诱导抗菌肽表达,杀伤病原微生物^[15]。VD水平降低时能增加自身免疫疾病的风险，如1型糖尿病、多发性硬化症和克隆氏病^[16]。维生素D缺乏还能增加病毒性感染的风险，包括艾滋病病毒（HIV）和流行性感冒^[17][18][19]，也是患结核病的一个危险因素^[20]。补充1, 25 （OH）₂VD3对这些疾病及炎症性关节炎、炎性肠病和肺结核等具有预防或治疗作用，还可以减少发生系统性红斑狼疮的风险。

在肿瘤方面，有生物活性的1, 25 （OH）₂VD3对大多数细胞具有抗增殖和促进分化作用，具有潜在的抗肿瘤活性。特别是1, 25 （OH）₂VD3刺激细胞周期抑制子p21和p27及细胞粘附分子E-钙粘蛋白的表达，同时抑制β-连环蛋白的转录活性。维生素D也可以抵抗细菌和病毒感染。体内充足的维生素D营养状况可以预防一系列的癌症，如膀胱癌、前列腺癌、甲状腺癌、淋巴瘤、胃癌等^[21]。但研究发现，服用维生素D补充剂对患癌症的风险没有显著影响^[22]。而一些研究已经表明,维生素D3降低癌症的死亡率,但关于这方面的数据的性质被关注^[23]。

活性维生素D调节激素分泌，胰腺的β细胞内存在VDR和调节胞内钙浓度的钙结合蛋白-D28K，1,25(OH)₂VD与维生素D受体（VDR）结合可调节胰岛素分泌。维生素D缺乏，能够增加发生2型糖尿病的风险。血清25（OH） VD可以作为免疫调节剂用于肾移植，血清25（OH） D在肾移植中具有保护移植肾的功能^[24]。

在心血管疾病方面，维生素D缺乏人群冠心病、心力衰竭和周围血管疾病的患病率显著增加^[25] 。维生素D缺乏易引起呼吸道的感染，并且与哮喘的发生存在着相关性。在精神疾病方面，维生素D的缺乏可能增加抑郁症、精神分裂症，认知障碍和孤独症谱系障碍等心理疾病的风险；.也是慢性肾脏病发生的危险因素。妊娠期间VD缺乏与子痫前期、胰岛素抵抗和妊娠期糖尿病相关。

维生素D在体内的营养状态，与临床上多个系统、多种疾病的发生发展都有密切的关系，被称为“疾病预防的明日之星”^[26]。但长期或大剂量的使用维生素D，能使血清25（OH） VD的浓度升高和高钙血症，临床上表现出中毒症状。有研究者认为，血清25（OH） VD>100ng/ml称维生素D中毒。因此，维生素D在人体内扮演着重要的角色，检测体内维生素D的水平也成为一种趋势。

维生素D是有生物学上的惰性，其必须在体内经过两次羟基化才能被激活具有生物活性。维生素D进入体内循环系统，与血液中的载体蛋白即维生素D结合蛋白结合，然后运输到靶组织和储存的位点，主要是脂肪和肌肉^[7]。当维生素D运送到肝脏，它经过C25位点的CYP27A1酶的羟化作用转化成25羟基维生素D，又称为骨化二醇（25OHD）。这是维生素D 在体内的第一次代谢，6个六个细胞色素P450亚型(CYP27A1,CYP2R1、CYP2C11 CYP3A4,CYP2D25和CYP2J3)全部参与了维生素D3 25羟基化的活动^[8]。25羟基维生素D转运出肝脏与维生素D结合蛋白结合，然后转运到肾脏在C1α位点的CYP27B1酶再次羟基化的作用下，最后转变成具有生物活性的骨化三醇，即1α,25（OH）₂D。当体内1α,25（OH）₂D含量充足时，它在CYP24酶的作用下转化成24,25(OH)₂D（Fig.1.2）。骨化三醇是肾脏中的活化形式，并且也能与维生素D结合蛋白结合，被转运到有维生素D受体表达的靶组织，主要有骨骼，小肠和甲状旁腺，然后以基因组或者非基因组的形式发挥其作用。25羟基维生素D的浓度最高，最稳定，半衰期最长（大于两周），是维生素D在体内的主要运输形式。因此，血清25(OH)D水平是评价体内的维生素D状态的最有效的指标^[9]。

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技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种维生素D结合肽及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种维生素D结合肽，其基序为IYSLAASSELPHVYMRKQS（SEQ ID NO：1）。

进一步的，基序的一端连接有不多于3个的氨基酸。

进一步的，其序列为IYSLAASSELPHVYMRKQS。

上述维生素D结合肽在制备维生素D结合蛋白抗原中的应用。

一种维生素D结合蛋白抗体，由偶联有上述维生素D结合肽的载体诱导动物体得到。

一种维生素D结合蛋白抗体的制备方法，包括将上述的维生素D结合肽与增加免疫原性的载体偶联，之后刺激动物体，接着制备筛选出单克隆抗体，最终得到维生素D结合蛋白抗体。

作为上述方法的进一步改进，增加免疫原性的载体为纯蛋白衍化物PPD。

一种维生素D定量检测试剂盒，所述试剂盒为ELISA试剂盒，其使用的维生素D结合蛋白抗体由偶联有上述维生素D结合肽的载体诱导动物体得到。

本发明的有益效果是：

本发明的维生素D结合肽，可以作为抗原很好地诱导出针对维生素D结合蛋白的抗体，进而对维生素D结合蛋白进行精确定量，实现体内维生素D含量的定量检测。

附图说明

图1是VD2的小鼠免疫强弱的筛选结果；

图2是VD2的杂交瘤筛选结果。

具体实施方式

下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。

抗原的制备：

1)取人工合成的多肽序列IYSLAASSELPHVYMRKQS（标记为VD2）4℃下溶解于2ml 0.02 M的盐酸中，然后再加到40ml的乙醚中进行萃取，充分摇匀后静置、分层后取最底部的分层，即溶解的多肽；

2)PPD的配备：称量10mg的PPD溶解到1ml的磷酸盐缓冲液（PBS）中,再加入10mg的malsac（EPSILON-N-MALEIMIDOCAPROIC ACID-(2-NITRO-4-SULFO)-pHENYL ESTER SODIUM SALT，Ε-N-马来酰亚胺己酸(2-N-4-S)苯酯钠盐）混合30分钟。然后吸取混合液加入到事先用0.1M PBS(5-10ml)洗过两次的圆柱中，一段时间后，用EP管收集呈灰色的分层，即为溶解后的PPD。溶解后的多肽和PPD再一起加入到0.5M PBS（0.5ml）中，快速地在液氮的冷气里过一下，然后在室温摇匀过夜。第二天再用PBS稀释到5ml，分装EP管中备用（1ml/管），剩余的可储存到-80℃；得到由多肽偶联到结核菌素制成的抗原。

将配置好的PPD与弗氏佐剂（Freund adjuvant）混合均匀，得到VD2免疫剂。

免疫小鼠：第一步先卡介苗尾部皮下注射免疫小鼠，使小鼠产生免疫反应，进一步产生抗体作为下一步多肽免疫的载体蛋白。一个月后，开始第一次多肽的免疫，第一组小鼠肌肉注射0.1ml配备好的VD2免疫剂；对照组小鼠只肌肉注射等量的生理盐水，首次注射的免疫剂量中要至少包含20ug的纯多肽。一个月之后，所有小鼠再重复注射一次加强免疫。经过20天免疫后，剪小鼠尾部取血，测定小鼠对注射的免疫剂的免疫程度。尾部取2-3滴血稀释到0.5ml的PBS中，然后离心取其上清液储存。以储存的上清液为样本，用ELISA技术进行检测，看小鼠体内免疫应答情况。然后对免疫反应强的小鼠再进行一次加强免疫。28天之后对前一次免疫应答强的小鼠只注射合成肽最后一次加强免疫。对实验组加强免疫时，对照组都注射同剂量的生理盐水。再3天之后，杀死免疫反应强的小鼠取其脾脏，然后用不含血清的DMEM冲洗几次，加入冻存液（90%FBS+10%DMSO），液氮冻存备用。

小鼠尾部血的筛选

取小鼠的尾部血为样本，用包被液（0.2M碳酸氢盐溶液，pH9.6）作为稀释液，把这多肽配备到所需要的体积，多肽的浓度稀释到10ug/ml,每个孔里加入100ul的含有多肽的稀释液，用密封膜密封，在潮湿的环境并室温下，放置2天。孵育2天之后，先用洗涤液洗涤2遍，洗涤液的配方是：0.05M Tris-HCl pH7.5,0.15M NaCl,0.05%Tween-20。洗去多余的包被液，加入100 ul的封闭液（5%BSA,PBS,0.2% Tween-20）封闭一个小时。一个小时之后，洗涤2遍，加入100 ul从小鼠尾部取的血浆，室温下孵育2个小时。然后再洗去未结合血清中的抗体，加入用Tris共轭缓冲液（1%BSA, 25Mm Tris-HCl, 0.15M NaCl）按1：1000比例稀释的酶标二抗（anti-mouse IgG），室温下孵育1小时之后，洗去未特异性结合的抗体和酶标抗体，每孔加入50ul的四甲基联苯胺过氧化物酶底物，在足够的我们需要的颜色出现后，每孔加入100ul的终止液（1M sulfuric acid）。在加入终止液30分钟内，用酶标仪读每个孔在450nm下的吸光度。

细胞融合

复苏一冻存管的小鼠的骨髓瘤细胞（SP2），用DMED的完全培养液（500mlDMEM，50ml胎牛血清，10ml青霉素/链霉素）进行培养，因为SP2细胞是悬浮细胞，所以每一小培养瓶加入10ml的培养液，给予细胞足够的生存空间。SP2细胞至少在融合之前1周开始培养，每天观察细胞的生长状态，大概一周的时间之后，取一点细胞液进行细胞计数，保证有足够的活着的SP2细胞用于融合，至少要有2x10⁷个细胞。计数之后用50ml的无菌离心管收集SP2细胞，室温下，1000rpm的离心力离心10分钟，吸取旧的培养液，尽可能的吸尽。然后加入20ml预热的不含血清的DMEM，上下吹打几次，在193xg离心力下离心15分钟，重复3次此步骤以充分洗去粘附在细胞上的血清，吸尽上清液。在处理SP2的同时，一起处理小鼠的脾脏细胞，在不含血清 DMEM培养液中把要用于融合的脾脏切成小块并分解成单个脾脏细胞，收集脾脏细胞，以和SP2同样的方法处理脾脏细胞。用不含血清的DMEM培养液重悬脾脏细胞，然后把脾脏细胞转移到收集SP2细胞的离心管里，充分混合后离心（193×g）15分钟，重复2次，完全地吸除上清液避免稀释下一步PEG的浓度，影响两种细胞的融合。在细胞融合之前，必须把不含血清的DMED培养液、HAT选择培养液和配备好的无菌的PEG放在37^OC的水浴锅里预热。PEG的配方是10mg的PEG溶解到10ml的无血清的DMEM培养液中，因为PEG的粘性较大，在低温下很难溶解，所以应放在水浴锅里溶解，完全溶解后用过滤器进行过滤保持无菌性。在1分钟内缓慢的滴加1.5ml预热过的PEG到清洗过的脾脏细胞和SP2细胞离心管内，轻轻地晃动2分钟，要保证细胞的充分融合，此步骤要在37^OC的温水中进行。2分钟之后，加入1ml的无血清DMEM培养液，一分钟内滴加完毕，然后依次加入2ml、5ml、6ml、6ml无血清的DMEM培养液，逐步稀释PEG的浓度，也都分别在一分钟内完成，室温下静置2分钟，再转移到培养箱里静置5分钟，100xg的离心力离心10分钟，移除上清液并确保完全除去细胞内的PEG，避免PEG对细胞的毒性伤害。然后加20ml预热的HAT选择性培养基到融合的新细胞内，轻轻地吹打之后转移到一个大的培养瓶（75cm²）中，重复一次。把培养瓶放置到培养箱里培养2个小时，2小时之后，把融合的细胞转移到96孔板里，每个孔加200ul的HAT培养液，然后放到培养箱内进行培养（37℃, 5% CO₂）。

技术筛选杂交瘤细胞

HAT培养液是一种哺乳动物细胞培养的选择性培养基，它包含了次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)。氨基喋呤是一种有效地抑制RNA和DNA的起始合成途径，从而会阻碍骨髓瘤细胞(SP2细胞)的增殖。未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。而未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡。只有融合成功的杂交瘤细胞有从脾脏细胞内获得的HPRT酶，在HPRT酶的催化作用下，将能够用选择培养基里添加的次黄嘌呤和胸腺嘧啶作为原料通过中间合成途径合成RNA和DNA，使融合的细胞能够生存和无限增殖。

经过HAT培养液的筛选，只有杂交瘤细胞才能存活，大约14天之后，检测以确定哪些克隆体有兴趣的产生抗体。并不是所有的形成杂交瘤细胞的脾细胞是B细胞,因此，会混有一下杂交瘤细胞不能产生抗体；也有一些杂交瘤细胞是B细胞融合而成，有产出抗体的特性，但有产生抗体的惰性。因此，很重要的一步是筛选出能够产生单克隆抗体的细胞的克隆体。大量的克隆可能需要快速筛选并对筛选出的符合要求的克隆进一步培养。

融合的成功与否是通过间接ELISA技术对最佳条件下的杂交瘤细胞产生的特异性抗体的筛选决定的。

用10ug/ml的多肽包被96孔ELISA板，每孔内加入100ul的包被液，室温下过夜。第二天，在洗去多余的包被液后，加入100ul的封闭液，室温封闭一个小时。吸除封闭液之后，每孔加入100ul的培养过细胞的上层培养液，然后密封，室温下孵育过夜。第二天用洗涤液洗去未结合的培养液中的抗体，在吸水纸上重击甩干，随后加入50ul的二抗（与小鼠尾部筛选所用的抗体一样），孵育1个小时。然后洗去未特异性结合的酶标抗体，甩干96孔板，再加入50ul的TMB底物，避光，时刻注意观察颜色变化，最先出现颜色变化并且颜色深，说明杂交瘤细胞产生抗体的能力强。

一旦确认所需要的杂交瘤细胞，这些细胞必须克隆几次，以确保得到一个稳定、同类的克隆细胞，并确保其确实是单克隆抗体。所以，把筛选出的抗体产生能力强的杂交瘤细胞依次从96孔板转移到24孔、6孔、小的培养瓶中，并且培养液也依次从HAT选择培养液转换成HT培养液、完全培养液。

对得到的符合要求的克隆细胞进行细胞培养，收集细胞液的上清液，即得到未经纯化的单克隆抗体。随后使用亲和纯化法对单克隆抗体进行纯化。

维生素D结合蛋白合成多肽VD2免疫的小鼠免疫强弱的筛选结果如图1所示。从图中可以看出，每个小鼠对合成肽的免疫反应的强弱不同，同一组的每个小鼠对同一个多肽的免疫反应强弱也不相同。上图是用96孔板检测的结果，下图是检测时加入的样本在96孔板的对照位置，每种颜色代表了每一只小鼠。以96孔板作为固相，C1-C10和D1-D10的20个孔包被VD2；C11作为对照也分别固定上VD2。根据的原理，这一步实验是用ELISA的间接法来测小鼠体内抗体产生的情况，颜色越深说明样本中的抗体的浓度越高。从上图的图片中可以看出，实验组孔的颜色都比对照孔的颜色深，说明小鼠对注射到体内的多肽有免疫反应。同实验组不同小鼠之间对比，VD2组的8号和9号小鼠所对应孔的颜色较深，即8号和9号小鼠对VD2的免疫应答较强烈。因此，在免疫后期，杀死VD2组的8号和9号小鼠。

多肽杂交瘤细胞的筛选

图2是第一次对VD2杂交瘤细胞筛选的结果。96孔板是用VD2多肽包被，专门对于融合的VD2杂交瘤细胞的筛选。图2是对VD2杂交瘤细胞筛选加入停止反应液所显示的颜色，下图是与96孔板所对应的孔在450nm波长下的吸光度。H12是对照孔，加入的是未培养过细胞的新鲜HAT培养液。从图片上看，只有C6、E6、E7这三个孔颜色较深，所对应的吸光度也高，是所需要的杂交瘤。

<110> 广州军区广州总医院

<120> 维生素D结合肽及其应用

<130> VD2

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工多肽

<400> 1

Ile Tyr Ser Leu Ala Ala Ser Ser Glu Leu Pro His Val Tyr Met Arg

1 5 10 15

Lys Gln Ser