一种棉纤维发育相关基因GbWRKY40及其表达载体与应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，具体的，本发明涉棉花基因工程领域，更具体的，本发明涉及一种棉纤维发育相关基因及其表达载体与应用。

背景技术：

我国棉花总产量居世界首位，但纤维品质单一，无法满足国内对优质棉纤维的需求。优良纤维品质的形成需要良好的条件。基因型、激素、光照、温度都是影响纤维品质形成的主要因素。传统的棉花育种在很长一段时间内对纤维品质的提高做出了巨大的贡献。但近几年传统育种进入了颈瓶期，通过常规育种发方法已经很难再推出具有优良品质的新品种。随着生物信息学、棉花分子生物学、基因组学等学科的发展为利用分子手段来改良棉花纤维品质带来了广阔的前景。

通过转基因技术同步提高棉花纤维品质和产量是我国棉花育种的主要工作。棉纤维发育的整个过程由多个转录因子和基因共同调控。目前分离得到的相关基因仍无法系统的阐明棉纤维发育的机理。因此仍需要鉴定一些参与棉纤维发育的转录因子和基因。wrky转录因子在海岛棉优异纤维形成过程中的功能和分子机制研究不够清楚还需大量的研究来阐明其中的机理。

技术实现要素：

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种棉花纤维发育相关基因gbwrky40。

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：转录因子是调控蛋白，它可以激活或抑制生物体内多个靶基因的转录。参与植物生长发育、衰老、信号转导、物质代谢调控等过程。wrky结构域由一个锌指结构的c端和n端组成，其中n端含wrkygqk组成的高度保守的氨基酸序列，能够与基因启动子中的w-box特异性结合从而起到转录调控作用。wrky具有组织特异性特征，在不同植物的叶，茎，花，维管组织，果实，等组织中均有表达。其表达具有快速、瞬时等特点。与其他物种相比，棉花wrky基因特别是亚组i和ii通过多个全基因组重复和串联重复扩大。转录组分析表明，许多wrky基因参与特定的纤维发育过程，如纤维起始，伸长和成熟。

发明人根据前期研究，从海岛棉‘新海21’中克隆wrky基因，将其命名为gbwrky40，其碱基序列如seqidno：1所示。

本发明另一方面，通过将seqidno：1所示的片段酶切至载体pcambia1304获得棉花纤维发育相关基因植物表达载体pcambia1304-gbwrky40。

本发明的第三方面，提供一种改善棉花纤维品质的方法，该方法包括步骤：

克隆棉花纤维发育相关基因；

构建棉花纤维发育相关基因植物表达载体；

利用农杆菌侵染法将棉花纤维发育相关基因植物表达载体转入棉花。

进一步地，所述棉花纤维发育相关基因为gbwrky40，其碱基序列如seqidno：1所示。

进一步地，所述棉花纤维发育相关基因植物表达载体为pcambia1304-gbwrky40。

本发明的第四方面，通过杂交的方法改善棉花纤维品质，包括步骤：

将具有棉花纤维发育相关基因gbwrky40的棉花作为父本或母本与不具有该基因的母本或父本进行杂交；

对子代进行棉纤维品质筛选，获得具有高品质纤维的棉花品种。

根据本发明的实施例，gbwrky40基因的表达可以增强棉花的抗旱性能。

发明人首次从海岛棉中克隆出抗wrky转录因子gbwrky40，并验证了gbwrky40基因在增强棉花纤维品质中的用途，为提高棉纤维品质育种提供重要的理论支持。此外，利用本发明的增强棉花纤维品质的方法，能够有效增强目的棉花的纤维品质，且简单方便、可重复性好，对棉花的生长发育无影响，适于推广应用。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施方式的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示本发明的一个实施例中的海岛棉新海21的rna琼脂糖电泳图；

图2显示本发明的一个实施例中的gbwrky40基因的rt-pcr扩增琼脂糖电泳图；

图3显示本发明的一个实施例中的gbwrky40蛋白亲/疏水性预测图；

图4显示本发明的一个实施例中的转基因烟草外源基因整合检测图；

图5显示本发明的一个实施例中的野生型植株与阳性植株生长表型图。

具体实施方式

下面具体实施方式是对本发明进行详细说明，下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

以下除另有交待，以下实施例中涉及的未特别交待的试剂及仪器，都可来自常规市售产品。

实验试剂

dnamarker(dl2000)、dnamarker(dl15000+2000)、琼脂糖凝胶dna回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自北京天根(tiangen)生化科技有限公司；transstartfastpfudnapolymerase试剂盒、大肠杆菌(e.coli)dh5α感受态购自北京全式金(transgenbiotech)生物科技有限公司产品；revertaidfirststrandcdnasynthesiskit购于赛默飞世尔(thermoscientific)科技公司；pmd19-t载体购自宝生工程(takara)大连公司；其他试剂均为国产分析纯。引物合成由北京华大(bgi)生物科技公司完成，测序工作由上海美季(majorbio)生物科技公司完成。

主要仪器设备

紫外分光光度计(colibrispectrometer)，梯度pcr仪(eppendorfpro)，电泳仪(六一dyy-6d型)，超净工作台(boxun-sd-cj-1fd)，恒温培养振荡箱(zhichengzhwy-200d)。

实施例1

棉花纤维发育基因gbwrky40的克隆及生物信息学分析

1.材料

以海岛棉“新海21”为试材(均由新疆农业大学作物遗传育种实验室提供)。海岛棉“新海21”结铃性强，品质好，产量高且稳定是研究海岛棉纤维的最适材料。

2.方法及结果

2.1海岛棉总rna的提取

(1)制备rna提取液：2％ctab，4％pvp，100mmol.l^-1tris-hcl(ph8.0)，25mmol.l^-1edta(ph8.0)，2mol.l^-1nacl；

(2)取200～300mg海岛棉叶片，加入液氮研磨三次，快速将材料转移到2ml离心管中， 加入1ml提前预热(65℃)的提取液和1％的β-巯基乙醇，振荡15sec混匀，65℃水浴20min，中途摇晃2～3次以充分混匀预热；

(3)加0.6倍体积氯仿，混匀静置10min，4℃，12000rpm离心20min；

(4)将上清转移至新的2ml离心管中，加0.6倍体积氯仿重新抽提，重复2次；

(5)取上层水相加入1/10倍体积3mmol.l^-1naac和等体积的异丙醇放入-20℃沉淀4h；

(6)4℃，12000rpm离心20min，用70％乙醇洗涤沉淀风干；

(7)加入适量depch2o溶解，储存于-80℃。

提取的海岛棉总rna含量用colibrispectrometer紫外分光光度计测定。结果表明提取的总rna其od260/280值在2.0以上，取3ul总rna经1％的琼脂糖凝胶电泳后28srrna和18srrna两条带明亮，清晰无拖尾，满足后续实验要求(图1)。

2.2cdna第一链的合成

以提取的海岛棉新海21叶片总rna为模板，thermo公司revertaidfirststrandcdnasynthesiskit说明书进行cdna第一链的合成。

(1)无rna酶的pcr管中，按顺序加入以下试剂：

(2)12μl混合物混匀后，65℃孵育5min，离心并冷却；

(3)将下列组分按照顺序加入；

(4)轻轻混匀，离心；

(5)42℃孵育60min；

(6)70℃加热5min终止反应；

(7)cdna置于-80℃保存备用。

2.3内参检测

ubq7内参引物序列如下：

ubq7f:5’-gacctacaccaagcccaagaag-3’

ubq7r:5’-tgagcccacacttaccacaatagt-3’

反应体系为:

内参检测pcr程序：

将所得的pcr产物于1.2％的琼脂糖凝胶上电泳检测。

2.4gbwrky基因的克隆与测序

根据棉纤维发育转录组库筛选得到的unigene序列设计gbwrky40、gbwrky40和gbhct基因引物，序列如下：

pcr扩增体系与内参检测反应体系相同见表2-5。扩增程序为：

电泳检测pcr产物。将目的条带进行纯化并与pmd19-t进行连接，连接体系如下：

将10ul连接液转化大肠杆菌dh5ɑ感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素(ampicillin)50mg/ml的lb固体培养基，放置在恒温培养箱(37℃)中10～12h后挑取单菌落，进行pcr检测，结果表明该基因orf为942bp(图2)，该基因编码313个氨基酸，等电点为8.46，分子量为34.1881kd，。将检测正确的菌液送上海美季公司(majorbio)测序，测序结果显示其碱基序列如seqidno：1所示。

2.5gbwrky基因的序列分析

采用ncbi数据库中的blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)程序进行同源序列的比对；用dnaman软件分析蛋白的理化性质；亲/疏水性分析用protscale[^120]软件(http://expasy.org/tools/protscale.html)；蛋白质结构域分析用smart软件(http://smart.embl-heidel-berg.de)；系统进化树分析由mege软件完成。二、三级结构分别由sopma(http://metadatabase.org/wiki/sopma)软件和swiss-model(http://swissmodel.expasy.org)软件预测^[121]。利用gossypiumbarbadenseannotationproject(http://cotton.cropdb.org)检索获得对应的基因组dna序列，采用gsds2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)在线分析基因结构。

在线生物信息学软件(protscale)分析gbwrky40蛋白的亲疏水性结果显示gbwrky40蛋白为亲水性蛋白(图3)。氨基酸序列211位置出现亲水性最高值-3.40(天冬酰胺)，在67位置出现疏水性最高值+3(丙氨酸)。在海岛棉基因组数据库比对发现gbwrky40基因全长1868bp，对应海岛棉基因组序列的gbscaffold17271.6.0，染色体位置在：scaffold17271:72937-74804，gbwrky40基因包含四个内含子和五个外显子。

实施例2

植物表达载体的构建

根据pcambia1304载体和gbwrky40基因序列设计了添加酶切位点ncoi和bglii 的引物，序列如下：

gbw3-1505-f:5'-tttccatggatggaatcgacttgggtgg-3'，

gbw3-1505-r:5'-tttagattaccacttgtgatctag-3'。

以pmd19-t-gbwrky40重组质粒为模板，进行pcr扩增，得到的目的片段进行纯化，回收产物与pcambia1304载体分别进行双酶切，酶切体系为：ncoi和bglii各5μl，10×buffer5μl，ddh2o15μl，双酶切回收产物/pcambia1304质粒20μl，总体积50μl。在t4连接酶作用下连接，连接体系为：t4ligasebuffer0.5μl，pcambia1304vector10μl，目的dna回收片段5μl，10×ligasebuffer2.5μl，ddh2o2μl总体积20μl；放入22℃恒温水浴锅连接20min，转化大肠杆菌dh5ɑ，放入37℃恒温培养箱培养12h后挑取单菌落。进行菌液pcr，随后送至上海美季(majorbio)公司测序，结果证明pcambia1304-gbwrky40序列正确。

实施例3gbwrky40基因功能验证

农杆菌的感受态制备与转化

(1)将低温保藏的农杆菌eha105甘油菌在含有利福平的固体yeb培养基划线，于28℃培养约2d；

(2)挑取单菌落接种于5mlyeb液体培养基中，于28℃振荡培养约2d；

(3)吸取2ml培养的菌液于50mlyeb液体培养基中继续培养，直至od600＝0.6；

(4)将菌液转至无菌离心管中，水浴30min,，4000rpm离心10min；

(5)用2ml20mmcacl2重悬菌体，按每管200μl分装于无菌离心管,农杆菌感受态细胞制备完成；

(6)在所制备的农杆菌感受态细胞中加入5～8μl植物表达载体的质粒dna冰浴5min；

(7)转移至液氮中冷冻8min。迅速于37℃水浴5min；

(8)加入800μlyeb培养基28℃250r/min预培养4～5h；

(9)涂含有卡那霉素的yeb固体平板，28℃培养24～48h,可见农杆菌菌落长出；

(10)挑取单菌落，摇菌做菌液pcr。

之后用测序正确的重组质粒转化农杆菌eha105菌株，进行菌液pcr鉴定，得到1077bp的目的条带，证明pcambia1304-gbwrky40重组质粒已经被成功转入农杆菌。

无菌苗的获得

取少量本生烟草种子与1.5mlep管中。在超净工作台上75％乙醇处理30s随后10％h2o2(hydrogenperoxide)处理10～15min，多次用无菌水冲洗种子表皮的药物后种于ms培养基上16h/8h光暗培养。

浸染本生烟草

配置固体yeb(含kan50mg/l和rif50mg/l)培养基，划线培养pcambia-wrky32的重组质粒，待长出单菌落，接种于5ml(含kan50mg/l和rif50mg/l)液体培养基中28℃，250rpm振荡培养36h，按照1:100的比例扩大培养至od600＝0.8左右4000rpm离心10min。得到的菌液用ms液体培养基重悬至od600在0.6左右，在无菌环境下取生长健壮的叶片用灭过菌的打孔器将叶片打成直径为1cm的小圆片。将叶片放入重悬好的菌液中28℃振荡培养15～30min,取出叶片，无菌滤纸吸干表面的菌液。叶面朝下，接种于共培养基上(ms+1.0mg/l6-ba+0.1mg/lnaa，ph5.8)25℃黑暗培养2d，之后将叶片转接于分化筛选培养基(ms+1.0mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+20mg/lhyg+500mg/lcef，ph5.8)。10～15d继代培养一次，直到分化出愈伤组织及抗性芽。待不定芽长到3cm以上时，切下并插入生根培养基(1/2ms+0.1mg/lnaa+20mg/lhyg+300mg/lcef,ph5.8)上，两周左右长出不定根，再将苗移栽到(土：蛭石＝2:1)土壤上培养。获得转基因植株。

转基因烟草的分子检测

提取转基因烟草总dna，以重组质粒pcambia-wrky32为阳性对照，野生型烟草为阳性对照，用带酶切位点的引物和hyg位点的特异性引物进行dna水平检测。序列如下：

gbw3-1505-f:5'-tttccatggatggaatcgacttgggtgg-3'，

gbw3-1505-r:5'-tttagattaccacttgtgatctag-3'。

hyg-f:gatgttggcgacctcgtatt,

hyg-r:tcgttatgtttatcggcacttt。

提取rna进行荧光定量pcr检测，qpcr引物序列如下：

gbw1-qp-f：5'-aaccaatcaaaggttctcctcatc-3'，

gbw1-qp-r：5'-agatgactcaagaaccaaaggtgc-3'。

转基因烟草植株提取dna用带双酶切位点的引物和潮霉素(hygromycin)筛选特异引 物，野生型植株的dna作为阴性对照，pcambia1304-gbwrky40重组质粒作为阳性对照进行扩增，经过电泳检测后8个植株扩增出942bp的特异条带，初步表明外源基因成功整合到烟草基因组当中(图4)。

转基因烟草的形态观察

wrky转录因子参与植物生长发育的多个过程包括种子萌发、形态建成、衰老等。本研究发现生长10d的转gbwrky40基因烟草长出4～5片新叶，而野生型植株长出7～8片新叶，转gbwrky40基因植株叶片数量要少于野生型植株。在茎的变化上转基因植株的茎细而长，野生烟草茎粗短。转基因植株在移栽到土里45d左右开始开花，野生型植株在60d左右开始开花，开花数量上转gbwrky40基因烟草多与野生性植株(图5)。

烟草叶片和茎表皮毛的观察

取同一时间生长的转gbwrky40基因和野生型植株同等大小叶片和茎，在体式显微镜下放大6.3×，40×，80×观察表皮毛发育情况。发现转gbwrky40基因植株叶片表皮毛的数量明显多于野生型植株表皮毛，但在长度上没有明显变化。在茎中得到了同样的结论。表明转gbwrky40基因可能在表皮毛发育中发挥一定作用。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。