本发明涉及微生物领域，具体的说是涉及一种修复重金属污染土壤的微生物菌株及其筛选方法和应用。
背景技术：
：近年来，我国工业化和城镇化飞速发展。工业规模的不断扩大，住宅、公路、铁路及各类公共设施的建设等侵占了大量耕地，以至耕地面积急剧减少。而且大量可用耕地因工矿排污灌溉农田、农药化肥的大量施用以及固体废弃物的堆放等遭受污染，导致环境质量恶化，绿色植被受到侵蚀，农作物大量减产或具有毒性。重金属污染土壤具有隐蔽性，累积性，滞后性，一旦发生便很难恢复。目前，我国土壤受镉、镍、砷、铜、铅、汞等重金属污染严重，导致耕地土壤中有益菌大量减少，自净能力减弱，影响农作物的产量与品质。耕地是农业经济和生态环境可持续发展的必要条件，耕地资源的持续开发利用关系到国民经济及粮食安全问题，因此，耕地的保护及治理迫在眉睫。近年来，“镉大米”事件在南方地区多有发生。由于耕地土壤受到重金属镉的污染，导致稻米中镉含量超标。镉是人体非必需元素，具有一定的致癌和致突变性，少量进入人体便可通过生物放大和生物积累对人体产生一系列损伤，在人体内累积性，长期会导致急性肺炎、肺水肿，损害肾功能等。镉的水溶性强、活性大、毒性高、难降解，目前已成为农业环境中超标率最高的重金属污染物，镉污染耕地已涉及11个省25个地区，给人们的生活生产带来很多负面影响。重金属污染土壤的修复方法可分为物理法、化学法以及生物法。物理方法往往工程量大，能耗大；化学方法大多花费高，易造成二次污染；生物法中的植物修复受到较多研究人员的青睐，但植物生长缓慢，修复周期长。目前比较受关注的修复技术大多处于实验室试验阶段，且实验效果也不够理想，在实地修复中，我国并没有很好的成功案例。因此，寻找一种高效节能，经济环保的修复措施至关重要。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种修复重金属污染土壤的微生物菌株及其筛选方法和应用，所获得的微生物菌株对土壤中重金属镉具有较强的钝化作用以及耐受作用，通过钝化作用将镉固定在污染土壤中，降低镉的生物有效性，减少植物对其吸收利用，从而达到修复污染土壤的目的。为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明利用液相富集法对镉钝化微生物菌株进行了筛选。（1）称取适量镉污染土壤样品加入到装有LB液体培养基的容器中，加入适量玻璃珠，在28~30℃、160~170rpm下振荡，获得土壤混合液；（2）将土壤混合液转入离心管，取离心后的上清液A作为镉钝化微生物的来源；（3）将步骤（2）获得的上清液A接种到含有镉的LB液体培养基中，在28~30℃、160~170rpm下振荡培养，培养完成后，离心，用无菌吸管吸取1-2mL上清液B转移接种至另一个含有镉的LB液体培养基中，在28~30℃下振荡培养，重复上述转移接种的操作3~5次，通过富集培养的方式对微生物菌株进行驯化，驯化完成后获得的菌液，分别在LB固体培养基和无机盐固体培养基上进行平板划线，分离单菌落；（4）取步骤（3）获得的单菌落制成菌悬液，离心后取上清液C，将上清液C分别稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，吸取适量涂布于含有50、100、200、300mg/LCd2+的LB固体培养基上，28~30℃培养3~4天；该菌株在稀释10-6倍数时易于菌株单独分离，在100mg/LCd2+的LB固体培养基上能正常生长，培养后取条件下菌株划线分离。通过上述方法，本发明筛选出一株微生物菌株，根据天根细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANampbacteriaDNAkit）步骤提取该菌株的DNA用于菌种鉴定；在比对匹配度最高的结果中，菌种所测得到的16SrDNA序列部分（SEQIDNO:1所示）与Bacillus（芽孢杆菌属）的16SrDNA序列有100%的同源性，可确定菌属为Bacillus（芽孢杆菌属）；与已知菌种的匹配中，与Bacillusmycoides(蕈状芽孢杆菌)的16SrDNA序列有100%的同源性；与Bacillusmycoides(蕈状芽孢杆菌)在RDP-II数据库中（S_abscore:1.000），序列相似性最高；可确定菌种为Bacillusmycoides(蕈状芽孢杆菌)，命名为cd-M。所述微生物菌株已于2014年12月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.10127。本发明还提供了含有保藏编号为CGMCCNo.10127的微生物菌株的组合物。在土壤重金属钝化效果评估中，主要是考察土壤可交换态重金属镉的钝化效果，即如果土壤中可交换态镉的含量越低，则土壤中镉的钝化效果越好，植物可利用度越低。加入本发明微生物菌株的菌液后土壤可交换态镉在10d内由36.49mg/kg降到0.78mg/kg；用水洗脱土壤，未检出Cd2+，这说明本发明菌株对土壤中的镉具有极强的钝化能力。此外，本发明所述菌株在水相中对镉具有极强的耐受性以及较强的钝化能力。基于上述技术效果，本发明还提出了保藏编号为CGMCCNo.10127的微生物菌株及含有上述微生物菌株的组合物在修复重金属污染土壤或制备重金属污染修复材料中的应用，其中，修复材料可用于修复水体或土壤中的重金属污染；作为优选，所述重金属为镉。在具体的应用方面，本发明提供了一种修复重金属污染土壤的方法，将保藏编号为CGMCCNo.10127的微生物菌株接种于微生物菌株培养基中，培养至对数生长期，获得菌液；将菌液加入含有重金属的污染土壤中，或将菌液用真空冷冻干燥机冻干后加入土壤中，混合均匀。作为优选，所述微生物菌株培养基为LB固体培养基、LB液体培养基、无机盐培养基或营养肉汤培养基。优选的，当所述微生物菌株培养基为LB液体培养基时，pH=6.8~7.0，包括以下重量百分比的组分：0.8~1.2%蛋白胨、0.4~0.6%酵母粉、0.8~1.2%氯化钠；当所述微生物菌株培养基为LB固体培养基时，pH=6.8~7.0，包括以下重量百分比的组分：0.8~1.2%蛋白胨、0.4~0.6%酵母粉、0.8~1.2%氯化钠、2~3%琼脂；当所述微生物菌株培养基为无机盐培养基时，pH=6.8~7.0，包括以下重量百分比的组分：0.1~0.2%KH2PO4、0.1~0.2%K2HPO4、0.1~0.2%NH4NO3、0.04~0.06%MgSO4、0.001~0.003%CaCl2、0.01~0.03%FeSO4•7H2O；当所述微生物菌株培养基为营养肉汤培养基时，pH=7.2~7.6，包括以下重量百分比的组分：0.8~1.2%蛋白胨、0.2~0.4%牛肉膏、0.3~0.6%氯化钠。更优选的，当所述微生物菌株培养基为LB液体培养基时，包括以下重量百分比的组分：1%蛋白胨、0.5%酵母粉、1%氯化钠；当所述微生物菌株培养基为LB固体培养基时，包括以下重量百分比的组分：1%蛋白胨、0.5%酵母粉、1%氯化钠、2~3%琼脂；当所述微生物菌株培养基为无机盐培养基时，包括以下重量百分比的组分：0.1%KH2PO4、0.1%K2HPO4、0.1%NH4NO3、0.05%MgSO4、0.001%CaCl2、0.01%FeSO4•7H2O；当所述微生物菌株培养基为营养肉汤培养基时，包括以下重量百分比的组分：1%蛋白胨、0.3%牛肉膏、0.5%氯化钠。作为优选，所述微生物菌株接种于微生物菌株培养基时，接种量为0.5~1%。上述筛选方法中所采用的LB固体培养基、LB液体培养基、无机盐培养基，与微生物菌株培养基中优选的LB固体培养基、LB液体培养基、无机盐培养基，可采用相同或不同的组分配比。本发明针对现有治理重金属污染土壤的物理化学方法具有一定局限性、实施成本高、对土壤破坏严重、易带来其他污染等问题，通过筛选出功能性微生物菌株的生物钝化作用来实现对污染土壤的原位修复。由以上技术方案可知，从受重金属镉污染的土壤中筛选出的蕈状芽孢杆菌，其能够将土壤中的可交换态镉钝化显著降低其含量，同时对镉具有极强的耐受性，对土壤扰动小，具有较强的生物修复功能，能够应用于修复重金属污染土壤和制备重金属污染修复材料中，且具有成本低、效果好、操作方便、对土壤扰动小等特点。生物材料保藏信息说明分类命名：蕈状芽孢杆菌，Bacillusmycoides，名称：cd-M，于2014年12月2日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.10127。附图说明图1所示为本发明所述微生物菌株的生长曲线。具体实施方式本发明实施例公开了一种修复重金属污染土壤的微生物菌株及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的微生物菌株和相关应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种修复重金属污染土壤的微生物菌株及其应用进行详细说明。实施例1：本发明所述微生物菌株的筛选液相富集法：（1）称取适量镉污染土壤样品，加入到装有LB液体培养基的三角瓶中，加入适量玻璃珠，将三角瓶在28~30℃、160~170rpm下振荡，获得土壤混合液。（2）将土壤混合液转入离心管，取离心后的上清液A作为镉钝化微生物的来源。（3）将步骤（2）获得的上清液A接种到含有镉的LB液体培养基中，在30℃、160-170rpm下振荡培养，培养完成后，离心，用无菌吸管吸取1-2mL上清液B，移入另一个含有镉的LB液体培养基中，如此转移三次，通过上述富集培养的方式对微生物菌株进行驯化，驯化完成后获得的菌液，分别在LB固体培养基和无机盐固体培养基上进行平板划线，分离单菌落。（4）取步骤（3）获得的单菌落制成菌悬液，离心后取上清液C，上清液C分别稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，吸取适量涂布于含有50、100、200、300mg/LCd2+的LB固体培养基上，28~30℃培养3-4d；比较菌株的生长状况，该菌株在稀释10-6倍数时易于菌株单独分离，在100mg/LCd2+的LB固体培养基上能正常生长，培养后取条件下菌株划线分离。通过上述方法，本发明筛选出一株微生物菌株，命名为cd-M。实施例2：本发明所述微生物菌株的鉴定根据天根细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANampbacteriaDNAkit）步骤提取cd-M的DNA用于菌种鉴定。在比对匹配度最高的结果中，菌种的所测得到的16SrDNA序列部分与Bacillus（芽孢杆菌属）的16SrDNA序列有100%的同源性，可确定菌属为Bacillus（芽孢杆菌属）。与已知菌种的匹配中，与Bacillusmycoides(蕈状芽孢杆菌)的16SrDNA序列有100%的同源性。与Bacillusmycoides(蕈状芽孢杆菌)在RDP-II数据库中（S_abscore:1.000），序列相似性最高。可确定菌种为Bacillusmycoides(蕈状芽孢杆菌)。实施例3：本发明所述微生物菌株的生长曲线将菌株接种于LB液体培养基中，接种量为0.5%~1%，30℃下160~170rpm振荡培养，间歇取样。如图1所示，4h时，进入对数生长期，10h到达稳定期，25h后生长有下降趋势，进入衰亡期，浓度最高能达到OD600为5.34。实施例4：本发明所述微生物菌株对重金属镉的钝化作用将菌株接种于LB液体培养基中，其中，LB液体培养基包括以下重量百分比的组分：1%蛋白胨、0.5%酵母粉、1%氯化钠，培养至对数生长期，直接将菌液加入含有重金属镉的污染土壤中，或将菌液用真空冷冻干燥机冻干后加入土壤，混合均匀。培养10-15d左右，用BCR连续提取法，提取土壤中各种形态的镉。并用清水洗脱土壤，测定可被植物吸收利用的可交换态镉，用ICP-AES检测。（1）菌株在水相对镉的耐受性向LB液体培养基中加入浓度分别为5，20，50，100mg/L的Cd2+，121℃灭菌15min。取0.5~1%的新鲜菌液，或在固体培养基上挑取单菌落接入培养基中。160~170rpm、28-30℃下培养，不同时间取样测OD值。在Cd2+浓度分别为5、20、50、100mg/L时，该菌株分别在4、5、9、16h时进入对数生长期，能达到的最高OD值分别为5.45、4.99、4.20和3.16。虽然不同浓度的Cd2+在不同程度上都对菌株的生长起到了抑制和延迟作用，但从数据表明，该菌株对Cd2+仍具有极强的耐受能力。（2）菌株在水相对镉的钝化效果取0.5%~1%的新鲜菌液，或在固体培养基上挑取单菌落接入经121℃灭菌15min的LB液体培养基中，160~170rpm，28~30℃下培养10-12h，然后菌液中加入浓度分别为5、20、50、100mg/L的Cd2+，继续振荡培养12h后，取5~10ml菌液，8000rpm离心5~10min，用ICP-AES检测上清液中残余Cd2+的浓度。公式如下:×100%该菌株对5、20、50、100mg/LCd2+的去除率分别为68.17%、89.33%、49.06%、26.16%。（3）菌株对土壤中镉的钝化效果取0.5%~1%的新鲜菌液，或在固体培养基上挑取单菌落接入经121℃灭菌15min的LB液体培养基中，160~170rpm、28~30℃下培养10~12h。将菌液或真空干燥后冻干的菌体加入到含有重金属镉的污染土壤中，搅拌均匀，培养10d，保证含水量为20~30%，10天后，将土壤在70℃下烘干，准确称取1g，用BCR连续提取法，提取土壤中各种形态的镉。具体做法如下：a．可交换态：准确称取通过100目筛的风干土壤样品1g，加40mL0.1mol/L的HAc，放在恒温振荡器中24±1℃下连续振荡16h，然后5000r/min下离心15-20min；取上清液，用ICP-AES测定Cd2+含量；加入无菌水清洗残余物，振荡20-30min，离心，弃去清洗液。b．可还原态：向a离心分离出的残渣中加入40mL0.5mol/L的盐酸羟胺，放在恒温振荡器中24±1℃下连续振荡16h，然后5000r/min下离心15-20min；其余步骤同步骤a。c．可氧化态：向b离心分离出的残渣中加入10mLH2O2，搅拌均匀，室温下静置1h左右后用水浴加热保持85℃±2℃1h左右，再加入10mLH2O2，在恒温水浴箱中加热保持85℃±2℃1h左右；冷却后，加入50mL1mol/L的NH4Ac，放在恒温振动器中24±1℃下连续震荡16h，然后5000r/min下离心15-20min；其余步骤同步骤a。d．残余态：向c离心分离出的残渣中加入10mLHNO3，使酸和样品充分混合均匀；进行微波消解；微波消解仪消解系统的最佳条件见表1。表1微波消解仪消解系统的最佳条件e．测总量：准确称取过100目筛的风干土壤样品0.5g，加入10mLHNO3，微波消解方法同上。f.水洗脱：将处理前后的土壤样品烘干或自然风干后过100目筛，准确称取5g土壤，加入20ml无菌水，置于恒温振荡器中振荡洗脱16h，然后离心测定上清液中被洗脱下来镉的量。表2为各种形态的镉检测结果。表2土壤中各形态镉检测结果（mg/kg）镉形态处理前含量处理后含量水洗脱14.37未检出可交换态36.490.78可还原态30.2046.09可氧化态22.0130.21残渣态9.2620.46镉总量98.4598.13由上表可知，加入本发明微生物菌株的菌液后土壤可交换态镉在10d内由36.49mg/kg降到0.78mg/kg；用水洗脱土壤，未检出Cd2+，这说明本发明菌株对土壤中的镉具有极强的钝化能力。通过总量的检测，处理前后的镉总量基本一致，检测方法未造成镉的增加或减少，各种状态下的镉含量检测准确。以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。SEQUENCELISTING<110>中国烟草总公司广西壮族自治区公司国家烟草质量监督检验中心广西壮族自治区烟草公司百色市公司<120>修复重金属污染土壤的微生物菌株及其筛选方法和应用<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1403<212>DNA<213>蕈状芽孢杆菌<400>1agtcgagcgaatggattaagagcttgctcttatgaagttagcggcggacgggtgagtaac60acgtgggtaacctgcccataagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggat120aacattttgcactgcatggtgcgaaattgaaaggcggcttcggctgtcacttatggatgg180acccgcgtcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagcc240gacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggagg300cagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtga360tgaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtgctagttgaataag420ctggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcgg480taatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggtggtt540tcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactgggaga600cttgagtgcagaagaggaaagtggaattccatgtgtagcggtgaaatgcgtagagatatg660gaggaacaccagtggcgaaggcgactttctggtctgtaactgacactgaggcgcgaaagc720gtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaag780tgttagagggtttccgccctttagtgctgaagttaacgcattaagcactccgcctgggga840gtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagca900tgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaacc960ctagagatagggcttctccttcgggagcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagc1020tcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgcc1080atcattaagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatg1140acgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtaca1200aagagctgcaagaccgcgaggtggagctaatctcataaaaccgttctcagttcggattgt1260aggctgcaactcgcctacatgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcg1320gtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacc1380cgaagtcggtggggtaacctttt1403当前第1页1 2 3