本发明涉及水稻稻瘟病防治
技术领域：
，具体涉及水稻稻瘟病抗性基因Pita、Pib分子标记方法。
背景技术：
：水稻稻瘟病(Magnuprothegrisea.无性态，Pyriculariagrisea)是水稻最主要的病害之一。稻瘟病又称稻热病，因为害期、部位不同分为苗瘟、叶瘟、穗瘟、节瘟、谷粒瘟等类型，其中以叶瘟危害最大。稻瘟病广泛分布于水稻栽培的国家和地区，每年都造成严重损失。为了减少病虫害造成的水稻产量损失，人们多采用综合防止的措施，最主要的技术有两种：一是利用不断更新换代的化学农药；二是选择对主要病虫有抗性的良种。前者不仅成本较高而且污染环境，毒害人体，不利于现代农业的持续发展。因此改良水稻品种的抗性成为水稻育种工作者的重要目标之一。20世纪60年代中期，日本率先开展了水稻品种抗稻瘟病基因分析的研究工作，鉴定了最初的8个抗性位点上的14个基因，并建立了一套抗稻瘟病基因分析用的鉴别体系(JDCs，Japansedifferentialcultivars)，随后，国际水稻研究所和中国等产稻国也逐渐开展了水稻稻瘟病抗性遗传的系统性研究。截至2013年8月，已至少报道了68个抗稻瘟病位点共83个主效基因。这些基因成簇地分布于除第3染色体外的所有水稻染色体上(2个隐性，其它显性)，其中，Pb1,Pia,Pib,Pid2,Pid3,Pik,Pik-h/Pi54,Pik-m,Pik-p,Pish,Pita,Pita,Piz-t,Pi1,Pi2,Pi5,Pi9,pi21,Pi25,Pi36,Pi37,Pi56,PiCO39等23个基因已被成功克隆(Pi2、Pi9、Piz-t同为Piz位点上的复等位基因；Pi1、Pik-h/Pi54、Pik-m、Pik-p同为Pik位点上的复等位基因；Pid3与Pi25等位；Pia与PiCO39等位)。近年来开发了大批与抗稻瘟病基因紧密连锁的分子标记，特别是一些源于抗性基因(如Pita和Pib)本身序列开发的特异性分子标记(功能标记)，为快速、准确、系统地鉴定水稻品种抗稻瘟病基因型，以及高效开展抗稻瘟病基因聚合育种带来了新的契机。研究表明，稻瘟病抗性基因Pita位于水稻第12染色体的着丝点附近区域。Pita基因包含2个外显子和1个1463bp的内含子，编码一个长度为928个氨基酸的细胞质膜受体蛋白，由于出现了一个单核苷酸多态性(SNP)，即密码子GCT变为TCT，第918个氨基酸位点由抗病的丙氨酸变异为感病的丝氨酸，该位点氨基酸的变化对于抗性蛋白与无毒基因产物识别与否有决定性的影响，主效抗稻瘟病基因Pita在中国很多稻区表现高水平的稻瘟病抗性。Pib基因属于"NBS-LRR"类抗病基因，包含有4个内含子(164bp,810bp,1340bp,308bp)，全长cDNA由306bp的5'非翻译区(UTR,untranslatedregions)、3753bp的ORF和229bp的3'非翻译区等组成。Pib编码一个由1251个氨基酸组成的蛋白产物，该产物包含一个核苷酸结合位点(nucleotidebindingsite,NBS)和17个富亮氨酸重复序列(leucine-richrepeats,LRRs)，其中，氨基端的NBS区存在激酶1a,2和3a结构域单位，LRRs中部有8个成簇的半胱氨酸残基(Wangetal.,1999)。Pib基因会因环境条件的变化而诱导调控，如温度、光照等条件的改变都将影响该基因的表达(Wangetal.,1999)。Pib基因定位于水稻第2染色体长臂近末端区域，与RFLP标记RZ123,C379,C2782B等连锁(Miyamotoetal.,1996；Monnaetal.,1997)。Pib基因定位于水稻第2染色体上RFLP标记S1916和G7030之间，遗传距离分别为0.015cM和0.045cM，并与RFLP标记G7010,G7021和G7023共分离(Wangetal.,1999)。对应于日本晴测序图谱的位置(5'-3')在35109965-35109117区间(RiceGenomeAnnotationProject:TIGRversion6)。水稻稻瘟病抗性基因pib来自品种"BL1"，对日本大多数稻瘟病菌小种有抗性，对中国的菌株ZB13和ZC15也表现抗病反应。利用抗稻瘟病基因Pib自身序列及其等位的感病基因序列建立的分子标记结合运用，可有效地从水稻种质资源中快速而准确地选择出抗稻瘟病基因pib，并能在分离世代群体中选择出含抗稻瘟病基因pib的纯合单株。主校抗稻瘟病基因Pita和Pib在我国很多稻区表现高水平的稻瘟病抗性，被广泛应用于我国的水稻育种和生产。江苏省农科院粮食作物研究所的王才林所长对江苏部分粳稻进行了抗稻瘟病Pita和Pib基因筛选，发现江苏的很多优异的粳稻如武运粳21、武运粳7号、宁7007，他们都包含有Pita和Pib基因。中国农业科学院作物科学研究所的时克对我国水稻主栽品种进行抗稻瘟病Pita和Pib基因检测，结果表明特籼占25、密阳46、测64-7等籼稻品种携带有Pita和Pib基因。因此，对已有的种子资源进行Pita和Pib基因筛选工作对田间育种具有重要的指导作用。技术实现要素：本发明公开了一种水稻稻瘟病抗性基因Pita、Pib分子标记方法，利用PCR引物扩增技术，分别将Pita和Pib基因分别扩增至YL155/YL87、YL183/YL87、PibdomF/PibdomR和Lys145F/Lys145R扩增片段上，然后采用凝胶成像仪进行分析确认，以明确区别Pita和Pib基因最终扩增至哪一片段上，过程简单、成功率高。为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：水稻稻瘟病抗性基因Pita、Pib分子标记方法，包括以下步骤：(1)抗稻瘟病种子资源的筛选，将粳稻、粘稻、籼稻、杂交粳稻、杂交粘稻、杂交籼稻、不育系和恢复系每个品种各取相同数量的嫩叶，用以获得PCR引物；所述PCR引物的基因通过NCBI网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov获得；(2)利于步骤(1)得到的PCR引物分别为YL155/YL87，片段大小为1042bp；YL183/YL87，片段大小为1042bp；PibdomF/PibdomR，片段大小为365bp；Lys145F/Lys145R，片段大小为803bp。(3)DNA材料提取，取植物新鲜组织加入液氮充分研磨，加入缓冲液FP1和的RNase，涡旋震荡，室温放置10min；加入缓冲液FP2，然后充分混匀，涡旋震荡1min；离心5min，将上清液转移至新的离心管中；将上清液再次离心5min，将上清液转移至新的离心管中；向上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，此时会出现絮状基因组DNA；离心2min，弃上清液，保留沉淀；加入600μL70％乙醇，涡旋震荡5sec，离心2min，弃上清液；此步骤重复一次；开盖倒置，室温晾干残余的乙醇；加入适量洗脱缓冲液TE，温水浴溶解DNA，得到DNA溶液。(4)将步骤(3)得到的DNA溶液进行PCR扩增操作。(5)将步骤(4)中的扩增产物进行琼脂糖胶电泳标记。作为本发明进一步改进的，所述步骤(3)中涡旋震荡的速度为500～3000r/min,优选为1200r/min。作为本发明进一步改进的，所述步骤(3)中离心过程的转速为10,000r/min～15,000r/min。作为本发明进一步改进的，所述步骤(3)中温水浴溶解DNA时的水温为45℃～75℃。由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：本发明方案的矩阵照明系统扫描驱动装置，利用PCR引物扩增技术，分别将Pita和Pib基因分别扩增至YL155/YL87、YL183/YL87、PibdomF/PibdomR和Lys145F/Lys145R扩增片段上，然后采用凝胶成像仪进行分析确认，以明确区别Pita和Pib基因最终扩增至哪一片段上，过程简单、成功率高。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。作物育种成效的大小很大程度上决定于掌握种质资源的数量多少和对其性状表现及遗传规律的研究深度。品种资源是在长期自然选择和人工选择过程中形成的，它们携带着各种各样的基因，是品种选育和生物学理论研究不可缺少的基本材料来源。筛选和确定作物育种的原始材料，也是作物育种的基础工作。能否灵活地、恰当地选择育种的原始材料，受作物品种资源工作的广度和深度的制约。稻瘟病抗性是水稻品种审定中的一个重要指标，因此对公司抗稻瘟病种子资源的筛选具有重要意义。实施方案如下所述：1、选取材料常规粳稻、籼稻、杂交粳稻、杂交粳稻、恢复系、不育系等种子资源，预计可以检测400份左右，每个品种提供7片左右嫩叶(7株混样取样)，具体的品种和数量由育种部及相关部门人员决定后提供给实验室。2、功能标记的引物设计基因序列通过NCBI网址(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)获得相关基因序列。参照相关文献和primer5.0引物设计软件设计引物(见下表1)。引物由上海生物工程有限公司合成。表1.PCR引物3、植物DNA提取DNA提取使用快捷型植物基因组DNA提取试剂盒(天根，北京)。DNA提取步骤如下：(1)处理材料：取植物新鲜组织100mg，加入液氮充分研磨，加入400μL缓冲液FP1和6μL的RNase，涡旋震荡1min，室温放置10min；(2)加入130μL缓冲液FP2，然后充分混匀，涡旋震荡1min；(3)12,000r/min离心5min，将上清液转移至新的离心管中；(4)将上清液再次12,000r/min离心5min，将上清液转移至新的离心管中；(5)向上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，此时会出现絮状基因组DNA。12,000r/min离心2min，弃上清液，保留沉淀；(6)加入600μL70％乙醇，涡旋震荡5sec，12,000r/min离心2min，弃上清液。此步骤重复一次；(7)开盖倒置，室温晾干残余的乙醇；(8)加入适量洗脱缓冲液TE，65℃水浴溶解DNA，最终得到DNA溶液。4、目的片段的PCR扩增使用PrimeSTARHSDNAPolymerase(TakaRa,China)以不同株的DNA为模板分别进行扩增。反应使用BIO-RADPCR仪器，反应体系及程序(表2、表3)。表2PCR反应体系反应所添加溶液加入量5×PrimerSTARbuffer(Mg2+plus)5μLdNTPMixture(各2.5mM)2μLPrimerF0.5μLPrimerR0.5μL模板DNA(50ng/μL)2μLPrimerSTARHSDNApolymerase(2.5U/μL)0.25μLddH2O14.75μL反应总体积25μL表3PCR反应条件5、扩增产物分析PCR产物用1.5％的琼脂糖胶电泳，在凝胶成像仪下分析结果。根据基因序列分析，4对引物的PCR扩增产物将有以下基因型：①能够用YL155/YL87扩增出1042bp片段，同时用YL183/YL87扩增不出产物的品种含有Pita基因；②不能用YL155/YL87扩增出目标产物(含微弱而不能重复的非特异性条带)，但是能用YL183/YL87扩增出1042bp片段的品种不含有Pita而含有其等位基因pita。③能够用PibdomF/PibdomR扩增出365bp片段，同时用Lys145F/Lys145R扩增不出产物的品种含有Pib基因；④不能用PibdomF/PibdomR扩增出目标产物，但是能用YLys145F/Lys145R扩增出803bp片段的品种不含有Pib而含有其等位基因pib。6、抗稻瘟病常规粳稻选育方案(选择大丰和三亚两个育种基地)：(A和B品种的选择需要根据实际情况选择合适的品种，参照引言部分材料说明有分部常规粳稻和籼稻都带有Pita和Pib基抗稻瘟病因。)品种选育的F5代开始对选择优异的单株进行稻瘟病Pita和Pib基因的辅助标记选择实验，实验方法参照上述(一)公司抗稻瘟病种子资源的筛选里的方法进行。筛选出来的品系同时要进行田间抗稻瘟病鉴定(鉴定方法参照稻瘟病鉴定方案)，从中筛选出抗稻瘟病的优质高产的常规粳稻。以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制。凡采用等同变换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。当前第1页1 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