本申请涉及基因突变检测领域，具体讲，涉及一种检测人JAK2基因突变的PCR试剂盒。
背景技术：
：JAK家族是一类非受体型酪氨酸蛋白激酶，包括JAK1、JAK2、JAK3和TYK2等4个成员。JAK2与信号转导蛋白和转录激活物(signaltransducersandactivatorsoftranscription，STAT)家族的多个成员共同构成了多条信号转导途径，能把细胞外信号与基因表达调控直接联系起来，启动相应基因的转录和表达，完成细胞因子受体如促红细胞生成素受体和促血小板生成素受体介导的信号转导过程，产生细胞增殖效应。此外，JAK2还介导粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素3以及生长因子等在内的多种细胞因子的信号转导，促进或调节细胞的增殖。骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferativeneoplasms，MPN)属获得性造血细胞克隆性疾病，是一种有不同血液学表现的综合征，可以主要表现为一种、二种或多种骨髓细胞的过度增殖，在疾病的进展过程中各型之间可能发生转换。2005年Baxter等首先报道了MPN患者中，JAK2基因第14号外显子1849位核苷酸G→T突变，导致JAK2氨基酸密码子617位缬氨酸被苯丙氨酸替代，即JAK2V617F。在JAK2的结构中，JAK同源结构域1(JAKhomologydomain1，JH1)为激酶域；而V617F位于与JH1相邻的JH2，后者为假激酶域，与JH1结合并抑制其激活。V617F突变使JH2失去了对JH1激酶活性的抑制作用，导致了JAK2的持续活化。此突变体作为一种组成性激活的酪氨酸激酶，在缺乏细胞因子的条件下可以自发激活自身和细胞因子受体，进而激活信号转导和转录活化因子5等下游信号转导通路。研究表明，JAK2(V617F)突变体在真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)和原发性骨髓纤维化(IMF)中的发生率分别高达81％～99％、41％～72％、39％～57％。在难治性贫血伴环形铁粒幼细胞伴显著血小板增多者中的检出率为40％～50％，在核心结合因子相关性急性髓系白血病中的检出率为3.5％等，但至今尚无淋巴细胞疾病、实体肿瘤或继发性骨髓增殖性病变中出现JAK2(V617F)突变的报道。因此，认为该突变可用于对骨髓增殖性肿瘤(MPN)患者的鉴别诊断。MPN传统的治疗手段包括减轻症状、预防血栓形成等并发症、物理方法去除增多的血细胞、抑制血细胞增殖以及造血干细胞移植等。近年来以JAK2V617F突变为靶点的药物研究为MPN的治疗带来了新的希望。Pardanani等发现应用JAK2激酶选择性抑制剂TG101209可抑制与JAK2V617F相关MPNs细胞的酪氨酸激酶活性，引起JAK2V617F、STAT3、STAT5的磷酸化受抑制，并且在裸鼠模型中显示出一定疗效。Tyler等、Geron等的研究显示，JAK2激酶选择性抑制剂TG101209和TG101348可分别在纳摩尔水平抑制携带JAK2V617F细胞的生长，纳摩尔浓度的抑制剂对含有突变基因的内源性红系集落具有生长抑制作用。研究也提示JAK2(V617F)的突变负荷有助于提示疾病的严重程度，因此随着JAK2V617F突变为靶点的药物研究为MPN的治疗尝试的不断深入，对JAK2(V617F)突变进行定量检测，不仅有助于临床诊断，同时对突变负荷数的分析还能有助于判断疾病的程度及监测微小残留病变。鉴于此，特提出本申请。技术实现要素：本申请的发明目的在于提出一种检测人JAK2基因突变的PCR试剂盒。为了完成本申请的目的，采用的技术方案为：本申请涉及一种检测人JAK2基因突变的PCR试剂盒，所述试剂盒包括核酸扩增试剂、对照品和参考品，其中，所述核酸扩增试剂包括以下组分，具体如表1所示：表1：编号组份组份中的主要成分1JAK2-MPCRMIX1用于检测突变型JAK2基因的引物和探针2JAK2-WPCRMIX1用于检测野生型JAK2基因的引物和探针其中，用于检测突变型JAK2基因的引物和探针中含有由SEQIDNO：1所示的上游引物，由SEQIDNO：2所示的下游引物，由SEQIDNO：4所示的探针；用于检测野生型JAK2基因的引物和探针中含有由SEQIDNO：1所示的上游引物，由SEQIDNO：3所示的下游引物，由SEQIDNO：4所示的探针；SEQIDNO：4所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有BHQ1。优选的，所述核酸扩增试剂包括以下组分，具体如表2所示：表2：编号组份组份中的主要成分3内控MIX内控引物和探针，以及内控质粒DNA其中，所述内控引物和探针中含有由SEQIDNO：5所示的上游引物，由SEQIDNO：6所示的下游引物，由SEQIDNO：7所示的探针；SEQIDNO：7所示核苷酸序列的5’端标记有ROX、3’端标记有BHQ2；所述内控质粒DNA中含有如SEQIDNO：10所示的核苷酸序列。优选的，所述JAK2-MPCRMIX1中各成分的含量为：浓度为50μmol/L的引物0.15μl，浓度为50μmol/L的探针0.1μl；所述JAK2-WPCRMIX1中各成分的含量为：浓度为50μmol/L的引物0.15μl，浓度为50μmol/L的探针0.1μl。优选的，所述核酸扩增试剂中还包括以下组分，具体如表3所示：表3：优选的，所述PCRMIX3中含有：10×Buffer液2.5μl，100mmol/LdATP、100mmol/LdCTP、100mmol/LdGTP、100mmol/LdUTP各0.025μl、5U/μl的TaqDNA聚合酶0.2μl、1U/μl的UNG酶0.1μl。优选的，所述对照品包括以下组分，具体如表4所示：表4：编号组分组分中的主要成分5阴性对照工艺用水6阳性对照质粒混合液优选的，所述质粒混合液中含有：由SEQIDNO：8所示的突变质粒DNA、由SEQIDNO：9所示的野生型质粒DNA。优选的，所述参考品包括以下组分，具体如表5所示：表5：编号组分组分中的主要成分7JAK2-M参考品1：1×106copies突变型质粒DNA8JAK2-M参考品2：1×105copies突变型质粒DNA9JAK2-M参考品3：1×104copies突变型质粒DNA10JAK2-M参考品4：1×103copies突变型质粒DNA11JAK2-W参考品1：1×106copies野生型质粒DNA12JAK2-W参考品2：1×105copies野生型质粒DNA13JAK2-W参考品3：1×104copies野生型质粒DNA14JAK2-W参考品4：1×103copies野生型质粒DNA本申请还涉及一种检测人JAK2基因突变的引物和探针，所述引物和探针包括用于检测突变型JAK2基因的引物和探针、用于检测野生型JAK2基因的引物和探针和内控引物和探针；所述用于检测突变型JAK2基因的引物和探针中含有由SEQIDNO：1所示的上游引物，由SEQIDNO：2所示的下游引物，由SEQIDNO：4所示的探针：所述用于检测野生型JAK2基因的引物和探针中含有由SEQIDNO：1所示的上游引物，由SEQIDNO：3所示的下游引物，由SEQIDNO：4所示的探针；所述内控引物和探针中含有由SEQIDNO：5所示的上游引物，由SEQIDNO：6所示的下游引物，由SEQIDNO：7所示的探针；SEQIDNO：4所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有BHQ1；SEQIDNO：7所示核苷酸序列的5’端标记有ROX、3’端标记有BHQ2。本申请的技术方案至少具有以下有益的效果：本申请的试剂盒采用等位基因特异性扩增定量PCR技术技术，对骨髓增殖性肿瘤相关基因JAK2(V617F)突变进行定量检测，从而辅助骨髓增殖性肿瘤临床诊断并指导相关患者的治疗和监测，具有高特异性、准确性和高灵敏度。1、灵敏度高：FQ-PCR的敏感度通常达102copies，且线性范围很宽。可在102～1010copies的范围内进行定量。2、特异性强：荧光探针和模板杂交的应用，并通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，故与传统的PCR技术相比，特异性大为提高。3、稳定性好：FQ-PCR结果相当稳定。因为域值设置在指数扩增期，各反应组分浓度相对稳定，CT值与荧光信号的对数呈线性关系。与终点法相比，能更精确地反映起始模板的拷贝数。4、污染小：一般PCR产物需通过琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色和紫外光进行观察，或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染进行检测，不仅需要多种仪器，而且费时费力，且染色剂溴化乙锭对人体又有害，这些繁杂的实验过程给污染和假阳性提供了机会。而本公司设计的试剂盒，采用荧光定量PCR，操作简便、省时、减少污染，避免了常规PCR操作中的诸多弊端。下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。具体实施方式等位基因特异型扩增法(AlleleSpecificAmplification，ASA)建立于1989年，是PCR技术应用的发展，也称扩增阻碍突变系统(AmplificationRefractoryMutationSystem，ARMS)、等位基因特性PCR(AlleleSpecificPCR，ASPCR)等。ASA主要用于对已知突变基因进行检测。首先设计两个5’端引物，一个与野生型DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3’端引物进行两个平行PCR，只有与突变DNA完互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物，如果错配位于引物的3’端则导致PCR不能延伸。随着荧光定量PCR技术的发展，将ASA和荧光定量PCR结合起来，形成了等位基因特异性扩增定量PCR技术，利用ARMS引物对突变靶序列进行特异性PCR扩增，利用Taqman探针对扩增产物进行检测，在实时PCR基础上鉴定特定突变。通过比较野生型引物和突变型引物扩增的CT值，即可得知扩增样本中的突变情况。如果目标位点是野生型，则野生型引物的扩增效率高于突变型引物，野生型引物扩增的CT值值较小；如为突变型，则野生型引物扩增的CT值较大；若为杂合型，野生型引物和突变型引物扩增的CT值十分接近。本申请的试剂盒由JAK2(V617F)基因特异性引物、荧光探针以及Taq酶等成份组成，采用PCR体外扩增的方法，利用实时荧光Taqman探针法，对人外周血或骨髓基因组DNA中JAK2(V617F)基因进行定量检测。通过比较野生型和突变型的百分比变化，判断样本中JAK2(V617F)基因突变的含量。采用两套参考品标准曲线进行分别定量以达到精准比值。本申请试剂盒对骨髓增殖性肿瘤相关基因JAK2(V617F)突变进行定量检测，从而辅助骨髓增殖性肿瘤临床诊断并指导相关患者的治疗和监测。本申请的试剂盒能检出在25ng人基因组DNA的背景下含0.1％的JAK2基因V617F突变。本申请的检测人JAK2基因突变的PCR试剂盒，包括核酸扩增试剂、对照品和参考品，其中，核酸扩增试剂具体如表6所示：表6：其中，用于检测突变型JAK2基因的引物和探针中含有由SEQIDNO：1所示的上游引物，由SEQIDNO：2所示的下游引物，由SEQIDNO：4所示的探针；用于检测野生型JAK2基因的引物和探针中含有由SEQIDNO：1所示的上游引物，由SEQIDNO：3所示的下游引物，由SEQIDNO：4所示的探针；SEQIDNO：4所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有BHQ1。内控引物和探针中含有由SEQIDNO：5所示的上游引物，由SEQIDNO：6所示的下游引物，由SEQIDNO：7所示的探针；SEQIDNO：7所示核苷酸序列的5’端标记有ROX、3’端标记有BHQ2；内控质粒DNA中含有如SEQIDNO：10所示的核苷酸序列。具体的，引物和探针的核苷酸序列具体如表7所示：表7：本申请的试剂盒中还含有对照品和质控品，具体如表8所示：表8：编号组分组分中的主要成分5阴性对照工艺用水6阳性对照质粒混合液7JAK2-M参考品1：1×106copies突变型质粒DNA8JAK2-M参考品2：1×105copies突变型质粒DNA9JAK2-M参考品3：1×104copies突变型质粒DNA10JAK2-M参考品4：1×103copies突变型质粒DNA11JAK2-W参考品1：1×106copies野生型质粒DNA12JAK2-W参考品2：1×105copies野生型质粒DNA13JAK2-W参考品3：1×104copies野生型质粒DNA14JAK2-W参考品4：1×103copies野生型质粒DNA其中，质粒混合液中含有：由SEQIDNO：8所示的突变型质粒DNA、由SEQIDNO：9所示的野生型质粒DNA；JAK2-M参考品1～4中含有由SEQIDNO：8所示的突变型质粒DNA，JAK2-W参考品1～4中含有由SEQIDNO：9所示的野生型质粒DNA。本申请还涉及检测人JAK2基因突变的引物和探针，引物和探针的序列为：用于检测突变型JAK2基因的引物和探针中含有由SEQIDNO：1所示的上游引物，由SEQIDNO：2所示的下游引物，由SEQIDNO：4所示的探针；用于检测野生型JAK2基因的引物和探针中含有由SEQIDNO：1所示的上游引物，由SEQIDNO：3所示的下游引物，由SEQIDNO：4所示的探针；内控引物和探针中含有由SEQIDNO：5所示的上游引物，由SEQIDNO：6所示的下游引物，由SEQIDNO：7所示的探针；SEQIDNO：4所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有BHQ1；SEQIDNO：7所示核苷酸序列的5’端标记有ROX、3’端标记有BHQ2。本申请试剂盒的使用方法为：1、样本处理：进行核酸提取(推荐使用商业化的试剂盒来提取DNA)，阴性对照与标本同时处理。提取完的核酸建议立即进行检测，否则请于-20℃以下保存。2、扩增试剂准备：从试剂盒中取出JAK2-MPCRMIX1、JAK2-WPCRMIX1、内控MIX以及PCRMIX3，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s。模板PCR反应液体系1人份均按如下配制：7μlPCRMIX1+13μlPCRMIX3+1μl内控MIX(PCR管数应为样本数、1个阴性对照及1个阳性对照之和)，将上述配制好的模板PCR预混液，分别按每管21μl的量，分装于各PCR管内。参考品PCR反应液体系1人份按如下配制：7μlPCRMIX1+13μlPCRMIX3(PCR管数应为4个参考品)，将上述配制好的参考品PCR预混液，分别按每管20μl的量，分装于各PCR管内。3、加样：取出试剂盒中对照品、两组参考品以及样本处理液，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s。分别加至装有上述PCR预混液的PCR管中。每个反应体系的总体积为25μl。盖紧PCR管盖，2000rpm离心10s后，将其移至检测扩增区，具体如表9所示：表9：4、PCR扩增：ABI7300、7500、VIIA7、Bio-RadCFX96、罗氏480荧光PCR检测仪扩增条件：42℃，5min；94℃，3min；(94℃，15sec；60℃，60sec)10个循环；(94℃，15sec；60℃，60sec)30个循环，且在此PCR循环中的第二步60℃时收集荧光信号，检测双通道为：FAM-TAMRA。ROX-none，参比荧光设定为none。反应体系为25μl。StratageneMx3000P、StratageneMx3005P、荧光PCR检测仪扩增条件：42℃，5min；94℃，3min；(94℃，45sec；60℃，80sec)10个循环；(94℃，45sec；60℃，80sec)30个循环，且在此PCR循环中的第二步60℃时收集荧光信号，检测双通道为：FAM，ROX；参比荧光设定为none。反应体系为25μl。5、检测：(1)基线的确定：选择荧光曲线波动较小，较稳定的那段作为基线，用户可根据实际情况自行酌情调整。起点设在信号已经降到背景高度且能维持平稳的地方，终点要避免覆盖信号已经开始有明显增长的地方。(2)阈值的确定：在阴性对照无扩增的情况下，阈值设定在无扩增曲线样本的最高点，即高于无扩增增长曲线(即在结果分析“Component”栏中无柺点出现)的最高点，且阴性对照未检出为原则，确定起始阈值。(3)计算机自动处理和分析数据。6、检测结果分析：(1)JAK2V617F突变百分比的计算方式：JAK2-M参考品1～4和JAK2-W参考品1～4分别设定为：1×106、1×105、1×104、1×103copies，在扩增结束后，由获得的相应两条标准曲线，分别得到每个样本JAK2基因V617F突变型的检测浓度(A)和JAK2基因野生型的检测浓度(B)。计算公式：JAK2V617F突变百分比＝[A/(A+B)]×100％(2)有效性判定：两套参考品中的各个参考品均应CT值＜28，且每组参考品应分别满足标准曲线拟合度的绝对值≥0.980。阴性对照JAK2-MPCRMIX1和JAK2-WPCRMIX1中的FAM通道CT值≥28或显示“Undet”，且ROX通道CT值＜28；JAK2-M阳性对照JAK2V617F突变百分比＞0.1％；待测样品中任何一个反应液的FAM或ROX通道必须至少有一个信号升起，否则提示加入的DNA质量不佳或者含有PCR抑制剂，需要重新提取DNA后或重新取样后再做。(3)结果判定：A.当JAK2-MPCRMIX1和JAK2-WPCRMIX1中的FAM通道CT值＜28时：(a)若样本的JAK2V617F％≤0.1％，则判定JAK2基因无V617F突变或低于最低检测极限。(b)若样本的JAK2V617F％≥1％，则判定JAK2基因有V617F突变。(c)若样本的JAK2V617F％在0.1％～1％之间，则判定JAK2基因有微量V617F突变。注：JAK2-MPCRMIX1和JAK2-WPCRMIX1检测浓度A、B均在5×106copies～5×102copies的线性范围内，定量结果由标准曲线得到相应浓度后按JAK2V617F突变百分比的计算公式获得相应JAK2V617F突变百分比例。B.若待测样品中JAK2-MPCRMIX1中的FAM通道CT值＜28，且JAK2-WPCRMIX1中的FAM通道的CT值≥28或显示“Undet”，则判定JAK2基因有V617F突变。C.若待测样品中JAK2-MPCRMIX1中的FAM通道CT值≥28或显示“Undet”，且JAK2-WPCRMIX1中的FAM通道CT值≤18，则判定JAK2基因无V617F突变或低于最低检测极限；若待测样品中JAK2-MPCRMIX1中的FAM通道的CT值≥28或显示“Undet”，且JAK2-WPCRMIX1中的FAM通道的CT值＞18，则提示加入的DNA质量不佳或者含有PCR抑制剂，需要重新提取DNA后或重新取样后再做。实施例1一种检测人基因突变的PCR试剂盒，其组成如表10所示：表10：本实施例PCR试剂盒各组分的包装及含量如表11所示：表11：实施例2：样本线性和参考品线性检测(一)样本线性1、准备线性质控品选取已确定浓度的JAK2V617突变型的JAK2-M质粒DNA和野生型的JAK2-W质粒DNA各100μl，制成高浓度样本(L0)，上述两个样本按进入反应体系DNA模板数计分别为5×106copies，并以此作为本申请实施例1试剂盒的样本线性质控品L0，然后用工艺用水以1：10梯度将L0样本进行系列稀释，分别得到两组线性质控品L0、L1、L2、L3和L4。具体如表12和表13所示：表12：表13：2、扩增试剂准备：从试剂盒中取出JAK2-MPCRMIX1、JAK2-WPCRMIX1、内控MIX以及PCRMIX3，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s。模板PCR反应液体系1人份均按如下配制：7μlPCRMIX1+13μlPCRMIX3+1μl内控MIX(PCR管数应为样本数、1个阴性对照及1个阳性对照之和)，将上述配制好的模板PCR预混液，分别按每管21μl的量，分装于各PCR管内。参考品PCR反应液体系1人份按如下配制：7μlPCRMIX1+13μlPCRMIX3(PCR管数应为4个参考品)，将上述配制好的参考品PCR预混液，分别按每管20μl的量，分装于各PCR管内。3、加样：取出试剂盒中对照品、两组参考品以及样本处理液，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s。分别加至装有上述PCR预混液的PCR管中。每个反应体系的总体积为25μl。盖紧PCR管盖，2000rpm离心10s后，将其移至检测扩增区。4、PCR扩增：ABI7300、7500、VIIA7、Bio-RadCFX96、罗氏480荧光PCR检测仪扩增条件：42℃，5min；94℃，3min；(94℃，15sec；60℃，60sec)10个循环；(94℃，15sec；60℃，60sec)30个循环，且在此PCR循环中的第二步60℃时收集荧光信号，检测双通道为：FAM-TAMRA。ROX-none，参比荧光设定为none。反应体系为25μl。StratageneMx3000p、StratageneMx3005p、荧光PCR检测仪扩增条件：42℃，5min；94℃，3min；(94℃，45sec；60℃，80sec)10个循环；(94℃，45sec；60℃，80sec)30个循环，且在此PCR循环中的第二步60℃时收集荧光信号，检测双通道为：FAM，ROX；参比荧光设定为none。反应体系为25μl。5、检测并分析数据：检测得到的实验结果如表14所示。表14：检测各相关样本线性质控品进入反应体系的模板数，以理论浓度的对数值为Y，实际检测CT值为X进行线性拟合，计算其线性相关系数r，结果符合“线性相关系数|r|≥0.980”的要求。(二)试剂盒系列参考品线性按照上述方法测定本申请实施例1试剂盒中参考品的样本线性，检测得到的实验结果如表15所示。表15：以参考品理论浓度的对数值为Y，实际检测的CT值为X进行线性拟合，计算其线性相关系数r，结果符合“线性相关系数|r|≥0.980”的要求。实施例3：准确性检测1、制备准确性质控品选取检定合格的JAK2V617F阳性的人外周血基因组DNA和人骨髓基因组DNA标本各两份，组成本申请实施例1试剂盒的准确性质控品，具体如表16所示：表16：编号标本种类JAK2-P1JAK2V617F阳性的人外周血基因组DNA，稀释至5ng/ulJAK2-P2JAK2V617F阳性的人外周血基因组DNA，稀释至5ng/ulJAK2-P3JAK2V617F阳性的人骨髓基因组DNA，稀释至5ng/ulJAK2-P4JAK2V617F阳性的人骨髓基因组DNA，稀释至5ng/ul2、其他步骤同实施例2；检测得到的实验结果如表17所示：表17：由表17的实验结果可知，各准确性质控品在相应的反应液中，检测结果阳性符合率为100％。实施例4：分析特异性检测1、制备分析特异性质控品选取检定合格的JAK2V617F阴性的人外周血基因组DNA和人骨髓基因组DNA标本各一份，组成本申请实施例1试剂盒的特异性质控品，具体如表18所示：表18：编号标本种类JAK2-N1JAK2V617F阴性的人外周血基因组DNA，稀释至5ng/μl；JAK2-N2JAK2V617F阴性的人骨髓基因组DNA，稀释至5ng/μl。2、其他步骤同实施例2；检测得到的实验结果如表19所示：表19：由表19的实验结果可知，各特异性质控品在相应的反应液中，检测结果阴性符合率为100％。实施例5：精密度检测1、制备精密度质控品选用JAK2V617F阳性的HEL细胞株基因组DNA和JAK2V617F阴性的K562细胞株基因组DNA按比例混合，作为本申请实施例1试剂盒的精密度质控品，具体如表20所示；表20：2、其他步骤同实施例2；用相应的反应液重复检测10次，检测得到的实验结果如表21和表22所示：表21：表22：由表21和表22的实验结果可知，检测结果均为JAK2基因V617F突变阳性且CT值的变异系数(CV，％)≤5％。实施例6：最低检测量检测1、制备最低检测量质控品选取JAK2V617F阳性的HEL细胞株基因组DNA和JAK2V617F阴性的K562细胞株基因组DNA按比例混合，总基因组DNA浓度为25ng/μl，突变比例为0.1％，作为本申请实施例1试剂盒的检测限质控品，具体如表23所示；表23：2、其他步骤同实施例2；检测得到的实验结果如表24所示：表24：由表24的实验结果可知，检测限质控品在相应的反应液中，本申请试剂盒能检出在25ng人基因组DNA的背景下含0.1％的JAK2基因V617F突变。本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。当前第1页1 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