高产吩嗪‑1‑甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法与流程

文档序号：11144948阅读：2540来源：国知局

本发明属于基因工程领域，涉及假单胞菌基因工程菌株及其构建方法，尤其是一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法。

背景技术：

我国常见的农作物病害生物达1600种，每年造成的损失约为1000亿人民币，严重地影响了我国农业的发展。近些年，化学农药的大规模使用导致了病虫害的抗药性不断增强。此外，高浓度和毒性的化学农药的应用，对农田、水环境也造成了很大的污染，严重威胁着我国的粮食安全和生命健康。因此，低毒性、低残留和不易产生抗药性的生物农药获得了各国政府和农药企业的极大关注。

与化学农药相比，生物农药具有毒性低、对环境友好和不易产生抗药性等明显优势，已经吸引了越来越多学者的关注并逐渐应用到生物防治实践当中。其中，上海交通大学彭华松课题组率先利用铜绿假单胞菌株M18开发出了具有广谱、高效、安全和能有效控制真菌性根腐和茎腐的生物农药吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid，简称PCA，CAS号为2538-68-3)，定名为“申嗪霉素”，主要用于防治水稻纹枯病、小麦赤霉病、黄瓜和西瓜的枯萎病、甜瓜蔓枯病、辣椒根腐病等，并获得了农业部颁发的新农药药证。

但最近相关研究发现，与PCA相比，另一种吩嗪类抗生素吩嗪-1-甲酰胺(phenazine-1-carboxamide，PCN)具有更好的安全性、稳定性及对植物病原菌的抑菌活性，在防治水稻纹枯病和小麦赤霉病等方面具有重要的应用价值。据报道，目前能合成PCN的微生物菌株有绿针假单胞菌PCL1391，铜绿假单胞菌PAO1，PUPa3，PUP6，MML221等，但由于PCN产率较低，尚未能大规模推广应用。上海交通大学彭华松课题组对筛选的一株绿针假单胞菌HT66进行基因工程改造后，PCN的产量已经达到1800mg/L并申报了中国发明专利(CN201310566864.5)，但是该产量距离PCN的工业化应用还存在一定的距离。因此，通过基因工程技术进一步改造该菌株将有利于提高PCN产量，实现其农业应用。

技术实现要素：

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法，克服现有菌株生产吩嗪-1-甲酰胺产量和效率较低的缺陷，提供一种用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其用途。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明涉及一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株，具体是敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基因组的lon基因、parS基因中的一个或两个基因而得到基因工程菌株；

或者，敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467rpeA、psrA单突变株或者双突变株基因组的lon基因、parS基因中的一个或两个基因而得到基因工程菌株；其中，所述单突变株为HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA，双突变株为HT66ΔrpeAΔpsrA。

优选地，所述lon基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示；所述parS基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述基因工程菌株为HT66Δlon、HT66ΔparS、HT66ΔlonΔparS、HT66ΔlonΔrpeA、HT66ΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrA、HT66ΔpsrAΔparS、HT66ΔlonΔparSΔpsrA、HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA、HT66ΔparSΔpsrAΔrpeA。其中，所述基因工程菌株HT66Δlon是敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基因组的lon基因而得到基因工程菌株；所述基因工程菌株HT66ΔparS是敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基因组的parS基因而得到基因工程菌株；所述基因工程菌株HT66ΔlonΔparS是敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基因组的lon基因、parS基因而得到基因工程菌株。

更优选地，所述基因工程菌株为HT66ΔlonΔparS、HT66ΔlonΔrpeA、HT66ΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrA、HT66ΔlonΔparSΔpsrA、HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA。

第二方面，本发明还涉及所述高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株的构建方法，具体是：敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基因组的lon基因、parS基因中的一个基因或两个基因，即可；

或者，敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467 rpeA、psrA单突变株或者双突变株基因组的lon基因、parS基因中的一个或两个基因而得到基因工程菌株；其中，所述单突变株为HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA，双突变株为HT66ΔrpeAΔpsrA。

优选地，所述lon基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示；所述parS基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述构建方法中，敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基因组的lon基因、parS基因中的一个基因的步骤具体包括：

i、扩增lon基因或parS基因片段的上下游同源臂；

ii、采用融合PCR法连接上下游同源臂并插入pK18mobsacB质粒中得lon基因或parS基因重组质粒；

iii、(a)使lon基因重组质粒上的lon基因上下游同源臂片段与HT66、HT66ΔparS、HT66ΔrpeA、HT66ΔrpeAΔparS、HT66ΔpsrA、HT66ΔpsrAΔparS、HT66ΔrpeAΔpsrA、HT66ΔrpeAΔpsrAΔparS基因组中的lon基因发生同源重组；

或(b)使parS基因重组质粒上的parS基因上下游同源臂片段与HT66、HT66Δlon、HT66ΔrpeA、HT66ΔrpeAΔlon、HT66ΔpsrA、HT66ΔpsrAΔlon、HT66ΔrpeAΔpsrA、HT66ΔrpeAΔpsrAΔlon基因组中的parS基因发生同源重组；

筛选阳性克隆，即得。

上述敲除中，所述pK18mobsacB质粒为假单胞菌和大肠杆菌的穿梭质粒。

第三方面，本发明提供一种基于所述基因工程菌株的吩嗪-1-甲酰胺合成方法，具体包括如下步骤：将所述基因工程菌株的种子发酵液接种于KB发酵培养基中，培养，即可。

优选地，所述种子发酵液的制备具体为：将所述基因工程菌株接种于KB培养基中，置于28℃、180转/分下培养至OD600为0.5～2.0，即得。

优选地，所述培养的条件具体为：24～30℃、100～300转/分钟、24～72h。

优选地，所述种子发酵液与所述KB发酵培养基的体积比为(1～10):100。

与现有技术相比，本发明的具备如下有益效果：

本发明具体是以绿针假单胞菌HT66为出发菌株，通过基因工程技术从HT66菌株基因组中分别或者同时敲除吩嗪合成过程中的lon、parS负调控基因，构建HT66Δlon、HT66ΔparS、HT66ΔlonΔparS基因工程菌株，使得吩嗪-1-甲酰胺(phenazine-1-carboxamide,CAS号为550-89-0，简称PCN)的产量大幅提高，能够更加有效由于生物防治。其中，基因工程菌株HT66ΔlonΔparS具有最佳效果。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为绿针假单胞菌HT66和lon敲除突变株中分别以内外部引物PCR扩增lon基因及其上下游片段的电泳图；

其中，从左到右依次为marker，HT66Δlon，HT66，空白对照；

图2为HT66Δlon、HT66ΔparS、HT66ΔlonΔparS基因工程菌的生长曲线图；

图3为HT66HT66Δlon、HT66ΔparS、HT66ΔlonΔparS基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图；

图4为HT66ΔlonΔrpeA基因工程菌的生长曲线图；

图5为HT66ΔlonΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图；

图6为HT66ΔparSΔrpeA基因工程菌的生长曲线图；

图7为HT66ΔparSΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图；

图8为HT66ΔlonΔparSΔrpeA基因工程菌的生长曲线图；

图9为HT66ΔlonΔparSΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图；

图10为HT66ΔlonΔpsrA基因工程菌的生长曲线图；

图11为HT66ΔlonΔpsrA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图；

图12为HT66ΔpsrAΔparS基因工程菌的生长曲线图；

图13为HT66ΔpsrAΔparS基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图；

图14为HT66ΔlonΔparSΔpsrA基因工程菌的生长曲线图；

图15为HT66ΔlonΔparSΔpsrA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图；

图16为HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图；

图17为HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图；

图18为HT66ΔparSΔpsrAΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明的绿针假单胞菌(Pseudomonas choloraphis)HT66，该菌株已在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏单位地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编为：430072，保藏日期为：2013年10月12日，保藏编号为：CCTCC NO:M 2013467。

实施例1、lon基因体外突变体的构建

根据绿针假单胞菌HT66基因组中lon基因及其上下游序列设计引物(见表1)：

表1

以该基因组DNA为模板，扩增基因组中的相应片段。

将上下游PCR产物通过融合PCR连接，并将融合PCR产物与pK18mobsacB载体分别使用EcoRI和XbaI酶切，过柱回收，使用T4连接酶连接，获得体外突变质粒。

用体外突变质粒转化大肠杆菌S17。将携带重组质粒的S17菌株充分活化，接种于含有卡那霉素50mg/L的LB培养基中，37℃，180转/分培养12h。将充分活化的HT66菌株接种于LB培养基中，28℃，180转/分培养12h。5000转/分收集并洗涤两种菌体，LB培养基重悬并以HT66：S17浓度比为3:1的比例混合与EP管中，静置1h；取混合菌液点在LB平板中，28℃培养24h；刮取长出来的混合菌落于LB中重悬，稀释涂布于卡那霉素50mg/L，氨苄霉素100mg/L的LB平板上，28℃培养2～3d后挑取单克隆涂布10％蔗糖平板中，28℃培养1～2d；挑取蔗糖平板上的单克隆，分别点在卡那霉素50mg/L的抗性LB平板及无抗LB平板上，培养12～24h；挑取在卡那霉素50mg/L抗性平板上不生长，但在无抗平板上能够正常生长的单菌落，即为同源重组成功的菌落。PCR验证HT66菌株的lon基因被敲除，并命名为HT66Δlon。

图1为绿针假单胞菌HT66和lon敲除突变株中分别以内外部引物PCR扩增lon基因及其上下游片段的电泳图；其中，M，Marker；Δ，lon基因敲除株HT66Δlon；WT，野生株HT66；N，空白对照组。左侧引物为内部引物lon-F/lon-R，右侧引物为外部引物lon-F1/lon-R2。内外部引物扩增结果表明，lon基因已被成功敲除。

实施例2、parS基因体外突变体的构建

根据绿针假单胞菌HT66基因组中parS及上下游序列设计引物(见表2)：

表2

以该基因组DNA为模板，扩增基因组中的相应片段。

将上下游PCR产物通过融合PCR连接，并将融合PCR产物与pK18mobsacB载体分别使用BamHI和HindIII酶切，过柱回收，使用T4连接酶连接，获得体外突变质粒。

用所得体外突变质粒转化大肠杆菌S17。将携带重组质粒的S17菌株充分活化，接种于含有卡那霉素50mg/L的LB培养基中，37℃，180转/分培养12h。将充分活化的HT66菌株接种于LB培养基中，28℃，180转/分培养12h。5000转/分收集并洗涤两种菌体，LB培养基重悬并以HT66：S17浓度比为3:1的比例混合与EP管中，静置1h；取混合菌液点在LB平板中，28℃培养24h；刮取长出来的混合菌落于LB中重悬，稀释涂布于卡那霉素50mg/L，氨苄霉素100mg/L的LB平板上，28℃培养2～3d后挑取单克隆涂布10％蔗糖平板中，28℃培养1～2d；挑取蔗糖平板上的单克隆，分别点在卡那霉素50mg/L的抗性LB平板及无抗LB平板上，培养12～24h；挑取在卡那霉素50mg/L抗性平板上不生长，但在无抗平板上能够正常生长的单菌落，即为同源重组成功的菌落。PCR验证HT66菌株的parS基因被敲除，并命名为HT66ΔparS。

实施例3、lon和parS双突变株HT66ΔlonΔparS的构建

将携带parS重组质粒的S17菌株充分活化，接种于含有卡那霉素50mg/L的LB培养基中，37℃，180转/分培养12h。将充分活化的HT66Δlon菌株接种于LB培养基中，28℃，180转/分培养12h。5000转/分收集并洗涤两种菌体，LB培养基重悬并以HT66Δlon：S17浓度比为3:1的比例混合与EP管中，静置1h；取混合菌液点在LB平板中，28℃培养24h；刮取长出来的混合菌落于LB中重悬，稀释涂布于卡那霉素50mg/L，氨苄霉素100mg/L的LB平板上，28℃培养2～3d后挑取单克隆涂布10％蔗糖平板中，28℃培养1～2d；挑取蔗糖平板上的单克隆，分别点在卡那霉素50mg/L的抗性LB平板及无抗LB平板上，培养12～24h；挑取在卡那霉素50mg/L抗性平板上不生长，但在无抗平板上能够正常生长的单菌落，即为同源重组成功的菌落。PCR验证HT66Δlon菌株的parS基因被敲除，并命名为HT66ΔlonΔparS。

实施例4、假单胞菌HT66及基因工程菌株HT66ΔlonΔparS的生长曲线测定

将菌株充分活化并接种于新鲜的KB培养基中，培养过夜后以最初OD600为0.02的浓度接种于发酵培养基，28℃，180转/分培养2～3d，并以一定的时间间隔测定菌液OD600。

图2为绿针假单胞菌HT66及其不同基因工程菌株的生长曲线。由图可知，敲除parS基因对菌株的生长影响不打；敲除lon基因会使菌株稳定期的OD600值略微下降，其中以双敲除株HT66ΔlonΔparS的稳定期OD600值最低，说明两个基因对菌体的生长有着复杂的影响。

实施例5、基因工程菌HT66ΔlonΔparS中PCN的生物合成

将活化后的绿针假单胞菌HT66及其基因工程菌株HT66ΔparS、HT66Δlon、HT66ΔlonΔparS分别接种于KB培养基中，置于28℃恒温摇床(180转/分)培养至OD600为0.5～2.0之间时，将上述菌液以1～10:100的体积比，加入到新鲜的KB发酵培养基中，24～30℃振荡培养，摇床转速100～300转/分钟，培养24～72h后收取菌液。取发酵液0.5mL加入3mL乙酸乙酯充分萃取后，取0.2mL有机相吹干后用乙腈溶解，并通过HPLC检测发酵液中吩嗪-1-甲酰胺产量。

HPLC检测条件：

流动相为乙腈-25mM乙酸铵，色谱柱为WondaSilC18-WRreversephasecolumn(5μm；4.6X250mm,Shimadzu,Japan)，检测波长为254nm，检测条件：0～2min，8％乙腈-92％25mM乙酸铵，2-20min，乙腈浓度从8％升至60％，乙酸铵浓度从92％下降至40％，20～21min，8％乙腈-92％25mM乙酸铵。

图3为绿针假单胞菌HT66不同基因工程菌株及野生株中吩嗪-1-甲酰胺的产量变化图。由图可知，敲除parS基因导致了PCN的产量由野生株的425mg/L上升到1102mg/L，敲除lon基因使PCN的产量由野生株的425mg/L上升到2053mg/L；两个基因的双突变株中PCN产量达到2425mg/L，为野生株的5.71倍。

实施例6

本实施例提供了一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株，具体是通过敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467rpeA、psrA单突变株或者双突变株基因组的lon基因、parS基因中的一个或两个基因而得到基因工程菌株；

其中，绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467 rpeA、psrA单突变株分为HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA，双突变株为HT66ΔrpeAΔpsrA；上述单突变株及双突变株相关信息公开于在先申请CN 103642714 A中。

参照实施例1至3提供的方法，将基因工程菌株HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA、HT66ΔrpeAΔpsrA的lon基因、parS基因中的一个进行敲除或者两个同时敲除，即得；包括基因工程菌株HT66ΔlonΔrpeA、HT66ΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrA、HT66ΔpsrAΔparS、HT66ΔlonΔparSΔpsrA、HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA、HT66ΔparSΔpsrAΔrpeA。上述基因工程菌株生长情况及PCN产量情况如图4至图18所示。其中：