一种灰略红链霉菌耐高温中性蛋白酶及其编码基因和应用的制作方法

本发明属于基因工程和现代酶工程技术领域，涉及一种灰略红链霉菌耐高温中性蛋白酶及其编码基因和应用，具体涉及一种耐高温中性蛋白酶及其编码基因序列、含有该编码基因序列的重组表达载体和转基因重组菌以及该耐高温中性蛋白酶的应用。

背景技术：

蛋白酶作为催化蛋白质多肽链中的肽腱水解的一类酶，广泛存在于植物茎叶果实、人和动物内脏及微生物(主要是细菌、真菌和放线菌)。细菌作为微生物蛋白酶的主要来源之一，其合成的蛋白酶具有较强的水解能力，因而在工业生产中具有更加广泛的应用。目前，产蛋白酶细菌研究最深入的是芽孢杆菌，主要有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus lichniformis)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumillus)等；枯草芽孢杆菌作为一种被美国食品药物管理局认可的安全菌种(无致病性、环境友好及抗逆性强)，是蛋白酶制剂大规模产业化的主要菌种，其能够产生酸性、中性及碱性蛋白酶，但以中性及碱性蛋白酶居多。一般而言，真菌合成分泌的蛋白酶种类多于细菌，然而真菌合成分泌的蛋白酶水解能力相对较低，并且稳定性及耐热性较差，产蛋白酶真菌主要有曲霉属和毛霉属，另外还有酵母菌，如嗜热圆酵母、解脂假丝酵母。

相对而言，产蛋白酶的放线菌种类较少，针对其展开的研究和获得的成果也较少，产蛋白酶的放线菌主要有灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、氟氏链霉菌(Streptomyces fradiae)以及变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)。经证实，链霉菌蛋白酶具有较强的热稳定性，能够耐受50℃以上的高温，且对多种金属离子及酶活抑制剂有较强的耐受能力。因此，链霉菌对于新型蛋白酶的研发具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种耐高温中性蛋白酶。

本发明的另一目的在于提供一种耐高温中性蛋白酶的编码基因。

本发明的另一目的在于提供一种含有上述的耐高温中性蛋白酶编码基因的重组表达载体或转基因重组菌。

本发明的另一目的在于提供一种上述的耐高温中性蛋白酶编码基因在表达耐高温中性蛋白酶中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种上述的耐高温中性蛋白酶在降解蛋白质中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现：

一种灰略红链霉菌耐高温中性蛋白酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

本发明提供的耐高温中性蛋白酶及其编码基因克隆自灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)，命名为JSD-1，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2012.01.09，保藏编号为CGMCC No.5706，具有下列核苷酸序列之一：

(1)序列表中的SEQ ID NO.1的核苷酸序列；

(2)编码序列表中的SEQ ID NO.2氨基酸序列的多核苷酸。

本发明的一种灰略红链霉菌耐高温中性蛋白酶编码基因序列是通过全基因组测序和PCR扩增的方式克隆获得，所涉及的实验技术包括链霉菌基因组及大肠杆菌质粒DNA的提取、PCR扩增、琼脂糖凝胶回收、连接、质粒酶切、转化、蛋白诱导表达及纯化、聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白酶活性的测定等；具体步骤为：以灰略红链霉菌基因组为模板，通过PCR扩增获得该蛋白酶编码基因序列，随后将该基因序列连接到表达载体pET-22b(+)上，并将重组质粒导入到特定的大肠杆菌表达菌株内，进而获得蛋白酶过表达重组菌株，最终通过IPTG诱导实现蛋白酶的体外高效表达，并收集菌体、破碎菌体，离心后获得粗酶液，之后进行蛋白纯化并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表达情况， 最后，测定该蛋白酶相关的酶学特征。

从灰略红链霉菌得到的耐高温中性蛋白酶具有以下特征：

1、该耐高温中性蛋白酶的编码基因长度为519bp，共编码172个氨基酸。

2、该耐高温中性蛋白酶的适合反应温度为40～65℃，优选为45～60℃。

3、该耐高温中性蛋白酶的适合反应的pH为5.0～11.0，优选pH为6.0～9.0。

4、该耐高温中性蛋白酶分别在1mM金属离子和1mM酶活性抑制剂下，对多种金属离子(Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺、Cd²⁺和Fe²⁺)及酶活性抑制剂(EDTA、DTT、SDS和NaN₃)均有较强的耐受能力，Zn²⁺可提高蛋白酶的活性，而EDTA可较大程度抑制该蛋白酶的活性。

上述的耐高温中性蛋白酶编码基因的重组表达载体或转基因重组菌株。所述的重组表达载体为将上述的耐高温中性蛋白酶编码基因插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达耐高温中性蛋白酶的重组表达载体，所述的大肠杆菌重组表达载体为pET-22b(+)载体。

所述的转基因重组菌为将上述的重组表达载体导入到大肠杆菌中，筛选得到表达耐高温中性蛋白酶的转基因重组菌，所述的大肠杆菌为Transetta(DE3)。

上述的耐高温中性蛋白酶编码基因在表达耐高温中性蛋白酶中的应用。

上述的耐高温中性蛋白酶及其编码基因在降解蛋白质中的应用。

一种表达耐高温中性蛋白酶的方法，是培养上述的转基因重组菌得到耐高温中性蛋白酶。

本发明所述的耐高温中性蛋白酶在天然的灰略红链霉菌内表达量和酶活性均较低，因此严重限制了其使用范围和效果。本发明利用基因工程技术，构建了该蛋白酶表达工程菌株，大幅度提高了目的蛋白酶的表达量，为该蛋白酶的高效表达与应用奠定了基础，可用于蛋白质的降解。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

第一.本发明通过构建外源表达载体，实现了该蛋白酶的体外过表达，并在重组蛋白C端添加聚组氨酸标签(HIS₆·Tag)的方法，保证蛋白生物学活性的同时也方便后续蛋白的纯化；

第二.本发明通过载体信号肽实现了目的蛋白的周质空间表达，保证了蛋白酶的活性和稳定性；

第三.本发明的耐高温中性蛋白酶的适用反应温度范围广，在35～65℃下都能保持较好的活性，特别是相比现有的蛋白酶，本发明的蛋白酶在较高温度55℃下，表现出很好的酶活性；同时本发明的蛋白酶的适用pH范围广，在pH为5～11下都能保持较好的活性；

第四.本发明的耐高温中性蛋白酶对多种金属离子(Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺、Cd²⁺和Fe²⁺)及酶活性抑制剂(EDTA、DTT、SDS和NaN₃)均有较强的耐受能力，这可降低酶在生产过程中对水和蛋白原料的纯度要求，避免了生产过程中的金属离子对酶活性的影响，提高了实际应用时的稳定性。

附图说明

图1为本发明的耐高温中性蛋白酶的基因序列片段PCR扩增图；

图2为本发明的耐高温中性蛋白酶编码基因的重组表达载体的酶切片段的示意图；

图3为本发明的重组蛋白酶外源表达的验证图；

图4为本发明的耐高温中性蛋白酶在不同温度(30～70℃)下蛋白酶活性的示意图；

图5为本发明的耐高温中性蛋白酶在不同pH值(3.0～11.0)溶液下蛋白酶活性的示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

1、灰略红链霉菌基因组提取和测序

将灰略红链霉菌孢子悬浮液接种于LB液体培养基中，于37℃、150rpm条件下培养3天，然后收集2.0mL菌液，12000rpm离心2min，并弃上清，收集菌体沉淀，之后加入180μL溶菌酶(20mg/mL)和20μL EDTA溶液(0.5M,pH 8.0)，37℃处理45min，加入4μL RNase A(100mg/mL)，震荡混匀15s，室温放置5min，随后按照细菌DNA提取试剂盒操作说明完成剩余操作，得到高纯度基因组DNA，最后通过琼脂糖凝胶电泳确定基因组DNA质量，确保无明显RNA条带，基因组条带清晰、完整、无降解、无污染。

采用第二代测序技术，构建不同插入片段长度的文库，采用Illumina Miseq(2×250bp)平台进行测序，收集测序的原始数据，对带接头、低质量的数据进行过滤，随后采用Newbler version 2.8对去除接头的测序数据进行从头拼接，构建Contigs及Scaffolds，最后使用GapCloser程序进行缺口填补得到链霉菌基因组草图。

2、蛋白编码基因功能和膜定位预测

采用Glimmer 3.0软件对全基因组序列进行基因预测，并采用SignalP 4.1分别对蛋白酶氨基酸序列进行信号肽模拟预测；结果表明蛋白酶N端存在明显的信号肽序列，推测该酶为胞外酶；以下所述的蛋白酶为切除信号肽后的成熟蛋白酶。

3、蛋白酶表达载体构建

根据蛋白酶基因序列，设计含有酶切位点的引物，序列如下：

SG-M-His-Nde I-F：

GGAATTCCATATGCGGGGGTGATGAGGGTGGCGGTG

SG-M-His-EcoR I-F：

GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGGGGCGCG TCGACCAGGGTCC

以灰略红链霉菌基因组DNA为模板，用含有Nde I和EcoR I酶切位点引物进行PCR扩增，获得蛋白酶基因序列，如图1所示，然后连接到PMD^TM 19-T载体，并将连接产物转入大肠杆菌DH5α内，挑选阳性克隆，摇菌提取质粒测序，并在37℃双酶切，回收蛋白酶基因片段，用相同内切酶酶切表达载体pET-22b(+)并回收载体DNA片段，将蛋白酶基因片段与载体片段混合，在16℃下，用T4DNA连接酶过夜连接，将连接产物转入DH5α感受态细胞内，通过蓝白斑筛选获得含有表达载体的阳性克隆，最后挑取阳性克隆接种于含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中，180rpm、37℃培养16h后提取质粒，双酶切验证，如图2所示。

上述PCR扩增条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s；68℃延伸45s；30个循环后，68℃终延伸3min。

4、蛋白酶过表达转基因菌株的构建

将上述蛋白酶表达载体转入到Transetta(DE3)大肠杆菌，在含有氨苄青霉素(100μg/mL)和氯霉素(25μg/mL)的LB固体培养基上筛选，获得重组表达菌株。

上述的Transetta(DE3)具有以下特征：该菌株是携带氯霉素抗性质粒BL21的衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子(AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA)对应的tRNA，提高外源基因，尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。

5、重组蛋白酶体外诱导表达与验证

挑取阳性克隆于含有氨苄青霉素(100μg/mL)和氯霉素(25μg/mL)的LB液体培养基中，在28℃震荡培养，当OD₆₀₀达到0.8-1.0时，加入IPTG和ZnSO₄溶液使其在发酵液中的浓度分别达到25μM和25mM，20℃继续培养20h进行诱导表达，然后将诱导表达培养好的发酵液离心收集菌体，利用破胞缓冲液洗涤菌体一次，再利用1/10发酵液体积的磷酸盐缓冲液重悬菌体后，在冰浴条件下利用超声波破胞至菌液澄清，13000rpm离心15min收集上清，上清液即为蛋白酶的粗酶液。

制备12.0％SDS-PAGE胶，将粗酶液与5×SDS-PAGE Loading Buffer比例混合，与沸水浴5min，每个点样孔上样20μL，在160V电压下电泳60-70min，直至溴酚蓝指示条带完全跑出胶。停止电泳，用考马斯亮蓝R-250溶液染色20min，然后用脱色液进行洗涤，直至背景色完全脱去，条带清晰可见，如图3所示，结果显示，该蛋白酶在第12h表达量最高。

所述的12％SDS-PAGE是由浓缩胶与分离胶构成的，其组分分别为：

分离胶：蒸馏水1.6mL，30％丙烯酰胺溶液2.0mL，1.5M Tris-HCl(pH 8.8)1.3mL，10％过硫酸铵(APS)0.05mL，10％SDS溶液0.05mL，TEMED 0.002mL；

浓缩胶：蒸馏水0.68mL，30％丙烯酰胺溶液0.17mL，1.0M Tris-HCl(pH6.8)0.13mL，10％过硫酸铵(APS)0.01mL，10％SDS溶液0.01mL，TEMED0.001mL；

所述的5×SDS-PAGE Loading Buffer组分：1M Tris-HCl(pH 6.8)1.25mL，SDS 0.5g，溴酚蓝25mg，甘油2.5mL，去离子水定容至5mL。小份分装(500μL)后与室温保存，使用前每小份加入β-巯基乙醇25μL。

所述的考马斯亮蓝R-250溶液组分为：考马斯亮蓝R-250 1.0g，异丙醇250mL，冰醋酸100mL，去离子水650mL。

所述的脱色液组分为：冰醋酸100mL，无水乙醇50mL，去离子水850mL。

6、重组蛋白酶的纯化及其在不同条件下酶学活性测定

收集细胞破碎后的上清液，经0.45μm醋酸纤维素膜过滤，之后通过Ni-NTA Resin与聚组氨酸标签(His₆·Tag)间的亲和吸附进行蛋白纯化，随后使用浓度为10mM-300mM的咪唑洗脱液对粗蛋白溶液进行洗脱，结果表明，当咪唑浓度为50mM-100mM时，蛋白纯化效果最佳。

采用福林酚法分别测定在不同温度(30℃～70℃)下孵育12h、不同pH值(3.0～11.0)下孵育7d、1mM金属离子(Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺、Cd²⁺和Fe²⁺)及1mM酶活性抑制剂(DTT、EDTA、SDS和NaN₃)处理1h，该蛋白酶酶液的残存活性；测定结果表明，当温度为55℃时，该蛋白酶具有最高催化活性，证明该蛋白酶对高温有很强的耐受力，如图4所示；该 蛋白酶在pH为7.0时具有最高的催化活性，表明该蛋白酶为中性蛋白酶，如图5所示。当pH为7.0且温度为55℃时，粗酶液的蛋白酶活性可达215.3U/mL，远远高于该蛋白酶在天然灰略红链霉菌的活性为48.2U/mL。

此外，本发明还确定了多种金属离子(Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺和Fe²⁺)及酶活性抑制剂(EDTA、DTT、SDS和NaN₃)对该蛋白酶活性的影响，如表1所示，本发明的蛋白酶对上述的金属离子和酶活性抑制剂均有较强的耐受能力，特别是由于该蛋白酶作为一种金属(Zn²⁺)酶类，Zn²⁺可提高蛋白酶活性，而EDTA作为金属离子螯合剂可较大程度的抑制该蛋白酶的活性。

附表1金属离子及酶活性抑制剂对蛋白酶活性影响

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。