高效降解豆粕抗原蛋白的芽孢杆菌及菌酶混合发酵的方法与流程

本发明涉及一种菌酶协同发酵降解饲料抗营养因子的方法，具体的涉及玉米、豆粕为主日粮的抗营养因子降解。

背景技术：

玉米豆粕麸皮为当前主要的饲料原料，而生大豆中含有大量的抗营养因子，比如胰蛋白酶抑制因子、凝集素、抗原蛋白、植酸以及非淀粉多糖。其中主要的抗原蛋白为大球蛋白和β-伴球蛋白。而饲粮中所含的麸皮同样含有较多的非淀粉多糖。不利于动物，尤其是幼龄动物的消化吸收。

传统的物理加工方法如加热、膨化可以破坏大量热不稳定的抗营养因子如凝集素。但是对于抗原蛋白、植酸、非淀粉多糖（如纤维素）的降解并不充分。通过微生物发酵的手段降解抗营养因子能耗低，降解充分，目前已然成为饲料行业发展的趋势。

然而目前的生物发酵饲料主要关注与对豆粕的发酵，对于复合饲料的发酵并不多见。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明提供了高效降解豆粕抗原蛋白的芽孢杆菌及菌酶混合发酵的方法。

一组高效降解豆粕抗原蛋白的芽孢杆菌，包括两株芽孢杆菌，属于枯草芽孢杆菌枯草亚种Bacillus subtilis subsp.subtilis ，一株命名为ZJUFA-1，另一株命名为ZJUFA-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心( CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏日期为2016年8月8号，保藏号分别为CGMCC NO：12823，CGMCC NO：12824；用于联合降解豆粕抗原蛋白。

一种菌酶混合发酵降解饲料抗营养因子的方法，将玉米、豆粕、麸皮配成复合饲料，以总质量3~5%添加芽孢杆菌发酵种子液，按0.5~1%添加非淀粉多糖复合酶酶液，混合搅拌均匀后，于30~40℃发酵24小时得到发酵混合饲料，向发酵混合饲料中添加5%的乳酸菌种子液，混合均匀后封装于厌氧发酵装置中，发酵48小时后即可得到成品饲料；

所述的芽孢杆菌发酵种子液制备步骤如下：

将新鲜培养的ZJUFA-1和ZJUFA-2分别接种入5mLLB液体培养基中，培养4~6小时，使OD₆₀₀达到0.5，按1mL培养后的一级种子液按终质量1%~3%加入玉米豆粕浸汁液中放大培养37℃12小时，得到二级种子液，随后按饲料总质量2.5%分别添加ZJUFA-1和ZJUFA-2二级种子液。

所述的玉米豆粕浸汁液制备步骤如下：按质量百分比， 配置4%豆粕粉，3%玉米粉，0.8%Na₂HPO₄·12H₂O ，0.4% (NH₄)₂SO₄ , 0.15% NH₄Cl，加入水搅拌10min，配制完成后，滤去不溶物质，90℃灭菌30min。

所述玉米、豆粕、麸皮质量配成为4.5:4.5:1。

所述的非淀粉多糖复合酶酶液主要包括木聚糖酶，纤维素酶和果胶酶。

所述的乳酸菌种子液制备步骤如下：将新鲜培养的乳酸菌单菌落接种至MRS培养基，37℃静置培养12小时后，按体积比1%加入豆粕浸汁液中，37℃静置培养12小时，得到乳酸菌种子液；豆粕浸汁的制备：按质量百分比，配置0.5%糖蜜，4%豆粕，2.5%麸皮，0.2% K₂HPO₄， 0.3%NaAc, 0.08% MgSO₄·7H₂O，0.03%MnSO₄，加入吐温-80 0.5mL/L, 调pH至6.5，滤去不溶物质，90℃灭菌30min。

本发明的有益效果

本发明所涉及的发酵菌株ZJUFA-1、ZJUFA-2经中国工业微生物保藏中心（CICC）鉴定，为枯草芽孢杆菌枯草亚种，中国普通微生物菌株保藏中心保藏号分别为CGMCC No. 12823、CGMCC No. 12824，所用乳酸菌为市场采购的粪肠球菌，均符合农业部发布的《饲用添加剂品种目录（2013）》，因此可用于生产推广。

本发明提供的复合菌群发酵经过反复试验，饲粮中抗营养因子降解效果明显，β-伴球蛋白降解率达87%，大球蛋白降解率为76%，酸溶蛋白含量提高6.5倍，中性洗涤纤维含量下降35%，植酸含量下降46%。

本发明提供的复合菌群发酵，乳酸含量达到174.57 mmol/kg，益生菌数目大于5.0×10⁹ CFU/g饲料，大肠杆菌含量小于1.0×10³ CFU/g，pH降低至5.0，可减少饲料中饲用抗生素的使用。

本发明提供的复合菌群饲料干物质消化率从59%提高至70%，粗蛋白消化率从78%提高至86%，必需和非必需氨基酸体外消化率分别提高了7.36% 和12.64%，具有发酵酸香味、诱食效果好，具备良好的生产应用前景。

附图说明

图1是ZJUFA-1菌株的16SrDNA序列进化树分析图；

图2是ZJUFA-1菌株的保守基因gryB序列进化树分析图；

图3是ZJUFA-2菌株的16SrDNA序列进化树分析图；

图4是ZJUFA-2菌株的保守基因gryB序列进化树分析图；

图5为采用本发明方法生产的发酵混合饲料的抗原蛋白电泳图；

图6为采用本发明方法生产的发酵混合饲料的乳酸及pH变化图；

图7为采用本发明方法生产的发酵混合饲料的微生物数量变化图。

具体实施方式

本发明所述发酵菌株中的豆粕抗原蛋白降解菌株ZJUFA-1、ZJUFA-2均为江浙沪腌菜中筛选的枯草芽孢杆菌枯草亚种，已于2016年8月8日保藏与中国普通微生物菌种保藏中心，编号分别为：CGMCC No. 12823 和 CGMCC No. 12824。所用乳酸菌采购自市场的粪肠球菌（可采用其他乳酸菌）。

玉米豆粕浸汁液： 4%（w/v）豆粕粉，3%玉米粉，0.8%Na₂HPO₄·12H₂O ，0.4% (NH₄)₂SO₄ , 0.15% NH₄Cl。加入清水搅拌10mins，配制完成后，用4层纱布滤去不溶物质，90℃灭菌30mins。

豆粕浸汁液（乳酸菌种子液）：0.5%糖蜜，4%豆粕，2.5%麸皮，0.2% K₂HPO4， 0.3%NaAc, 0.08% MgSO₄·7H₂O，0.03%MnSO4， 吐温-80 0.5mL/L, 调pH至6.5，用4层纱布滤去不溶物质，90℃灭菌30mins。

一种芽孢杆菌发酵种子液制备方法：

将新鲜培养的ZJUFA-1和ZJUFA-2分别接种入5mLLB液体培养基中，培养4~6小时，使OD₆₀₀达到0.5。按1mL培养后的一级种子液按1%~3%加入玉米豆粕浸汁液中放大培养37℃12小时，得到二级种子液。随后按饲料总质量2.5%分别添加ZJUFA-1和ZJUFA-2二级种子液。

一种非淀粉多糖复合酶酶液：

复合酶组成为木聚糖酶，纤维素酶和果胶酶，均购自某酶制剂公司，按说明书配制酶液，按推荐剂量使用（非淀粉多糖复合酶：木聚糖酶15000U/g, 纤维素酶6000 U/g，果胶酶500U/g）。

一种乳酸菌种子液制备方法：

将新鲜培养的乳酸菌单菌落接种至MRS培养基，37℃静置培养12小时后，按体积比1%加入豆粕浸汁液中，37℃静置培养12小时，乳酸菌种子液。

一种发酵玉米、豆粕、麸皮混合饲料的方法：

将玉米、豆粕、麸皮按一定比例配成复合饲料，加入20%的水分，使饲料含水率达到30%，以总质量3~5%添加芽孢杆菌发酵种子液，按0.5~1%添加复合酶酶液，混合搅拌均匀后，于30~40℃发酵24小时得到发酵复合饲料1。向发酵复合饲料1中添加5%的乳酸菌种子液，混合均匀后封装于厌氧发酵袋中。发酵48小时后即可使用。

实施例1 菌酶协同发酵降解玉米、豆粕、麸皮混合饲料中抗营养因子

按具体实施方式所述生产2吨发酵玉米、豆粕、麸皮混合饲料，对饲料样本进行抗营养因子检测。结果如表1所述：

由图5 、表1可知，相较于单菌发酵，芽孢杆菌混菌发酵后抗原蛋白的综合降解效果增强，相比于益生菌发酵，本发明加入生物酶之后在保持菌株降解抗原蛋白能力基础上，可进一步提高饲料中中性洗涤纤维、植酸的降解程度。

按具体实施方式所述生产2吨发酵玉米、豆粕、麸皮混合饲料，对饲料样本中乳酸、菌落数检测。结果如图6、7所示发酵3天后pH基本稳定，乳酸含量逐渐积累。大肠杆菌生长受抑制，饲料中主要菌群以乳酸菌、芽孢杆菌为主。

另经测定本发明提供的复合菌群饲料干物质消化率从59%提高至70%，粗蛋白消化率从78%提高至86%，必需和非必需氨基酸体外消化率分别提高了7.36% 和12.64%。