用于识别Gremlin‑1的核酸适配子及其应用的制作方法

本发明属于蛋白质检测技术领域，具体涉及一种用于识别Gremlin-1的核酸适配子及其应用。

背景技术：

Gremlin-1是一种高度保守的，含184个氨基酸，可糖基化和磷酸化的分泌型蛋白质。Gremlin-1可与骨形态形成蛋白(Bone morphogenetie protein，BMP)2、BMP4、BMP7，血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)，YWHAH和Slit蛋白结合，影响其生物学作用。Gremlin-1在胚胎发育、肢体形成、肾脏、肺脏等器官的发育过程中起着非常重要的作用。在个体发育完善后其表达逐渐减少，但是在有些病理过程如糖尿病肾病、特发性肺纤维化、青光眼等疾病中都能发现Gremlin-1表达的增高，且被证实Gremlin-1在这些疾病中有明显的促纤维化作用。同时，Gremlin-1与很多恶性肿瘤的发生都有关系，如宫颈癌，肺癌等。

SELEX技术即指数富集的配基系统进化技术(SystematicEv olution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)。利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的核酸适配体(Aptamer)。它的基本思想是：体外化学合成一个单链寡核苷酸库，由于每个不同序列的单链核酸可以自身折叠形成特异的二级结构，不同二级结构的单链核酸就有可能与不同靶分子或一个靶分子中的不同位点依照热力学原理结合，从而筛选出与靶分子结合的短链核酸即特异的适配子。核酸适配子能与多种目标物质高特异性、高选择性地结合，因此在生物传感器研究、疾病诊断、治疗等方向有广阔的应用前景。核酸适配子在亲和力和特异性方面可与抗体媲美，并且具有抗体所不具备的其他一些优点，如筛选周期短，能应用于大规模的工业生产；生产成本低，稳定性好，重复性强，生产中很少存在批次间的差异；没有免疫原性，没有毒性和明显的副作用；易于化学修饰，可以在合成时精确、定点连接其他功能基团和分子，如巯基、氨基和荧光素、生物素、酶或金属微粒等。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于识别Gremlin-1的核酸适配子及其应用。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开了一种用于识别Gremlin-1的核酸适配子，该核酸适配子命名为G-ap49，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

在所述核酸适配子G-ap49的核苷酸的5′端带有生物素标签。

所述核酸适配子G-ap49不带固定序列的结构为：

所述核酸适配子G-ap49能特异性识别Gremlin-1全长。

本发明还公开了上述核酸适配子在制备识别Gremlin-1的检测试剂中的应用。

本发明还公开了上述核酸适配子在制备识别Gremlin-1的检测试剂盒中的应用。

本发明还公开了含有上述核酸适配子的检测试剂。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开了一种识别蛋白质Gremlin-1的核酸适配子序列，通过SELEX方法成功筛选了特异性识别蛋白质Gremlin-1全长的核酸适配子。经过生物素标记后的核酸适配子可以应用于核酸蛋白质印迹(South-Western blotting)、基于适配子的酶联吸附试验(ELAA)、细胞及组织化学染色(Aptamer-based histochemistry and cytochemistry)。结果表明，大量制备的核酸适配子G-ap49可以特异性识别Gremlin-1。因此，G-ap49有望被开发为Gremlin-1的体外检测试剂盒，且可能具有较高的特异性及灵敏性。

附图说明

图1为筛选的核酸适配子G-ap49与重组人Gremlin-1亲和力结果；

图2为不带固定序列的G-ap49预测的二级结构图；

图3为G-ap49与重组人Gremlin-1特异性结合的Dot-blot印迹图；

图4为G-ap49结合重组人Gremlin-1的解离常数分析图；

图5为G-ap49分别与重组人Gremlin-1和小鼠纤维化肺组织所做的South-Westren blot图；其中，(a)为G-ap49与重组人Gremlin-1；(b)为G-ap49与小鼠纤维化肺组织；

图6为G-ap49稳定性实验结果；

图7-1，图7-2分别为改变G-ap49浓度，改变重组人Gremlin-1浓度所做的基于适配子的酶联免疫吸附试验；

图8为G-ap49用小鼠纤维化肝组织切片所做的组织化学染色；其中，A为normal rabbit IgG；B为anti-Gremlin-1Ab；C为ssDNA library；D为G-ap49；

图9为G-ap49用转染了重组质粒PEGFP-C2-hGremlin-1或PEGFP-C2的HEK293细胞爬片所做的细胞化学染色。

具体实施方式

本发明通过SELEX技术，成功筛选了识别重组人Gremlin-1的核酸适配子。人工合成的随机单链DNA文库通过SELEX方法筛选出与重组人Gremlin-1特异性结合的单链DNA，经测序获得该单链DNA序列后，通过人工合成大量制备，并进行生物素标记。结果表明带有生物素标签的核酸适配子可以特异性的识别重组人Gremlin-1，可以应用于核酸蛋白质印迹(South-Western blotting)、基于适配子的酶联吸附试验(ELAA)、细胞及组织化学染色(Aptamer-based histochemistry and cytochemistry)。下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

一、SELEX技术筛选核酸适配子

1、随机单链DNA(ssDNA)文库的构建和引物合成

1)构建并人工合成长度为76个碱基(nt)的随机ssDNA文库，两端为18个碱基的固定序列，中间为40个碱基的随机序列，文库容量大约为10¹⁵～10¹⁶(Takara公司，大连，中国)。

5′–GGACAAGAATCACCGCTC–N40–CGTACAGGAGGCATACAG–3′

2)合成引物：

上游引物：5′–GGACAAGAATCACCGCTC–3′

下游引物：5′–CTGTATGCCTCCTGTACG–3′

2、微孔板为介质的SELEX筛选

1)微孔板包被方法：将重组人Gremlin-1(R&D生物科技有限公司,明尼阿波里斯市,美国)按50ng/孔溶于50mM碳酸盐缓冲液(pH 9.6)，100μl/孔包被于Nunc 96孔酶联板上，4℃过夜，3％牛血清白蛋白(BSA)(SHMCK缓冲液配制：20mM Hepes，120mM NaCl，5mM KCl，1mM MgCl2，1mM CaCl2，pH 7.4)封闭，37℃2小时，备用，同时包被不加重组人Gremlin-1，只用3％BSA封闭的微孔，备用。

2)SELEX筛选方法：

a)取200ng文库ssDNA溶于100μl SHMCK缓冲液。将ssDNA 95℃热变性10分钟，立即冰浴10分钟，室温下放置10分钟。复性的ssDNA溶液中加入酵母tRNA(终浓度100μg/ml)及BSA(1mg/ml)。酵母tRNA及BSA用于去除文库中与其结合的ssDNA。

b)将以上混合溶液先加入BSA包被的微孔内，37℃孵育1小时，反筛去除与BSA结合的ssDNA。然后，将孔内液体转移至重组人Gremlin-1包被孔，37℃孵育1小时。弃去微孔中液体，用含有0.05％Tween-20的SHMCK缓冲液(SHMCKT)洗涤微孔，洗3遍，每次5分钟，洗去未结合的ssDNA。

c)微孔内加入洗脱缓冲液(7M尿素，0.5M NH4Ac，1mM EDTA，0.2％SDS)，95℃孵育10分钟。洗脱下来的与Gremlin-1结合的ssDNA，经酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，溶解于20μl TE缓冲液中(10mM Trise-HCl,1mM EDTA,pH8.0)。

d)对称PCR方法扩增筛选获得的ssDNA，PCR产物为双链DNA(dsDNA)，对称PCR体系为：

对称PCR反应条件为：

94℃预变性5分钟，95℃变性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸30秒，反应15个循环，72℃10分钟。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，经TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit将dsDNA回收，溶解于20μl TE缓冲液中。

e)不对称PCR方法获得ssDNA，不对称PCR体系为：

不对称PCR反应条件为：

94℃预变性5分钟，95℃变性30秒，51℃退火30秒，72℃延伸30秒，反应15个循环，72℃10分钟。

不对称PCR产物经10％变性丙烯酰胺胶(SDS-PAGE)电泳，银染分析ssDNA条带。切下含有ssDNA条带的丙烯酰胺胶，经Column PAGE Oligo Gel DNA Extraction Kit回收ssDNA。回收的ssDNA以吸光度OD260/280定量，用于下一轮筛选。

f)按照上述筛选方法，筛选15轮后获得的ssDNA经对称PCR方法获得dsDNA。dsDNA与pGEM-T easy载体连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α细胞。转化后挑取50个克隆，提质粒。

3)以含有所筛核酸适配子候选序列的T载体质粒为模板，不对称PCR方法获得带有生物素标签的ssDNA(biotin-ssDNA)，不对称PCR体系为：

不对称PCR反应条件为：

94℃预变性5分钟，95℃变性30秒，51℃退火30秒，72℃延伸30秒，反应15个循环，72℃10分钟。

4)核酸适配子与重组人Gremlin-1的亲和力检测

a)biotin-ssDNA按上述方法回收。回收的biotin-ssDNA(100nM)溶于100μl SHMCK缓冲液。将ssDNA95℃热变性10分钟，立即冰浴10分钟，室温下放置10分钟。

b)复性后的biotin-ssDNA分别加入BSA包被的微孔及重组人Gremlin-1包被的微孔内，37℃孵育1小时。弃去微孔中液体，用SHMCKT洗涤微孔，洗3遍，洗去未结合的ssDNA。

c)在上述每孔中加入辣根过氧化物酶标记的链霉素(HRP-streptavidin，1：2000，SHMCK稀释)100μl，37℃孵育1小时。弃去微孔中液体，用SHMCKT洗涤微孔，洗3遍，显色。

d)利用酶标仪在波长为450nm条件下进行分析。

e)亲和力检测实验重复三次，从50个克隆中最终选出亲和力排前10的候选适配子进行测序，RNA Structure v3.5软件进行二级结构分析。

测序结果显示，4个候选适配子(G-ap32,G-ap39,G-ap48,G-ap49)序列类似，仅个别核苷酸不同，其余6个序列各不相同，而这4个候选适配子中，G-ap49在预测的二级结构中自由能最低，稳定性最好，故选择G-ap49进行后续的实验(如图1)。同时二级结构显示，G-ap49可以折叠成由胸腺嘧啶(T)连接的具有两个颈-环的稳定结构(如图2)，这与文献报道的其他适配子的结构特点一致。

2、以斑点印迹实验(Dot-blot)验证G-ap49与Gremlin-1结合的特异性

1)重组人Gremlin-1及BSA分别点在PVDF膜上，每个斑点为200ng重组人Gremlin-1或BSA。10％脱脂奶粉(PBST稀释)封闭。

2)人工合成5′端带有生物素标签(Takara，大连，中国)的不带固定序列的G-ap49。将G-ap49 95℃热变性10分钟，立即冰浴10分钟，室温下放置10分钟。复性后的G-ap49与带有重组人Gremlin-1或BSA的PVDF膜孵育(80nM)，37℃孵育1小时。

3)PBST洗膜，每5分钟一次，洗3遍。然后用PBST稀释后的HRP-streptavidin(1:2000)与膜孵育，37℃孵育1小时。PBST洗膜，每5分钟一次，洗3遍。

4)ECL(enhanced chemiluminescence)显影。

如图3，不带固定序列的G-ap49与重组人Gremlin-1结合显示出斑点，且与BSA不显示斑点。证明不带固定序列的G-ap49与Gremlin-1也有很高的亲和力。

3、G-ap49的解离常数(Kd)分析

1)微孔板包被方法：同筛选过程

2)解离常数分析方法：

a)将带有生物素标记的G-ap49以SHMCK缓冲液稀释成不同浓度(7.9nM,15.8nM,31.6nM,62.5nM,125nM,250nM,500nM)。经变性复性后，加入重组人Gremlin-1包被的微孔。37℃孵育1小时。弃去微孔中液体，用SHMCKT洗涤微孔，洗3遍，洗去未结合的ssDNA。

b)每孔加入SHMCK稀释后的HRP-streptavidin(1:2000)100μl，37℃孵育1小时。弃去微孔中液体，用SHMCKT洗涤微孔，洗3遍，显色。

c)酶标仪波长450nm条件下进行分析。

d)分析数据经GraphPad Prism 6.0软件分析，获得Kd值。

结果显示如图4。G-ap49Kd为2.43nM，较低的解离常数提示G-ap49与Gremlin-1有较高的亲和力。

二、G-ap49的应用性研究

1、验证G-ap49在核酸-蛋白质印迹法(South-Western Blot)中的应用

1)、以重组人Gremlin-1做South-Western Blot

a)取重组人Gremlin-1 200ng,溶于10μl PBS中，加入2×SDS-PAGE loading buffer(体积比1：1)和适量的1M DTT(终浓度为0.1M)混匀后，于100℃的沸水浴10min，冰浴10min，12,000rpm离心后即可用于上样。

b)电泳与转膜：使用12％的聚丙烯酰胺胶进行电泳，电泳完后，常规半干转移仪转膜。用10％脱脂奶粉封闭膜。

c)一抗孵育：抗Gremlin-1抗体(生工生物工程,上海,中国,1:500，PBST稀释)，适配子G-ap49以相同方法孵育(80nM用PBS稀释)，室温1h后移至4℃过夜。

d)二抗孵育：次日，用PBST洗膜4次，每次5-10min，一抗为抗Gremlin-1抗体的PVDF膜加入HRP标记的山羊抗兔IgG(1:10000，PBST稀释)，以适配子G-ap49孵育的PVDF膜加入HRP-streptavidin(1:2000)，室温孵育1h。

e)用PBST液洗膜4次，每次5-10min，在暗室内加入ECL发光液，l min后压胶片曝光，观察结果并扫描图像。

2)、以组织标本做South-Western Blot

a)博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺组织蛋白的提取：取出冻存的肺组织，向其中加入200μl的RIPA裂解液及2ul PMSF(10mg/ml)。在冰上碾磨、超声、离心后，收集上清。经考马斯亮蓝G250结合法进行蛋白定量

b)制样：取处理好的肺组织，蛋白量约100μg，加入2×SDS-PAGE loading buffer和适量的1M DTT，混匀后，于100℃的沸水浴10min，冰浴10min，12,000rpm离心后即可用于上样。

c)余做法同以重组人Gremlin-1做South-Western Blot的过程。

结果如图5所示，其中，(a)为G-ap49与重组人Gremlin-1；(b)为G-ap49与小鼠纤维化肺组织；以重组人Gremlin-1做South-Western Blot，适配子G-ap49与抗Gremlin-1抗体在约25kDa的位置均有条带，与重组人Gremlin-1说明书提供的Gremlin-1蛋白分子量一致。表明G-ap49可以识别固定在PVDF膜上的变性Gremlin-1。以组织标本做South-Western Blot，G-ap49与抗体在大约25Kda，31Kda处出现相似的条带，提示G-ap49能特异性的识别组织中的Gremlin-1，其作用与抗体类似。

2、核酸适配子生物稳定性的初步研究结果

1)高糖细胞培养基DMEM中加入10％胎牛血清，100U/ml青霉素及100U/ml链霉素配制成完全培养基。将1μg G-ap49溶于100μl SHMCK缓冲液中，经变性复性后加入200μl培养的HEK293细胞中，置于细胞培养箱，37℃孵育。分别于0,6,12,18,24,30,36,42及48小时，从混合物中取样5μl，并以样品作为模板扩增双链DNA。

PCR体系为：

对称PCR反应条件为：

95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸30秒，反应20个循环，72℃10分钟。

2)PCR产物经10％变性丙烯酰胺胶(SDS-PAGE)电泳，银染分析双链DNA条带，如图6。

结果显示G-ap49与培养着HEK293细胞的完全培养基孵育36小时内，均可以从混合物中扩增出双链DNA。表明G-ap49在体外类似体液的条件中可以稳定存在36小时，这也为研发基于适配子的Gremlin-1血清学检测提供了依据。

3、验证G-ap49在基于适配子的酶联吸附试验即ELAA中的应用

本实验通过模拟酶联免疫吸附试验中的双抗体夹心法(具体系统：包被在微孔板上的抗Gremlin-1抗体作为捕捉抗体—重组人Gremlin-1—G-ap49作为示踪抗体—HRP-streptavidin作为显色系统)，用于验证G-ap49是否可用于酶联免疫吸附试验。

1)抗体包被：将抗Gremlin-1抗体(1:500用PBS稀释)溶于50mM碳酸盐缓冲液(pH 9.6),包被于Nunc 96孔酶联板上，4℃过夜，3％BSA(PBST缓冲液配制)封闭，37℃2小时，备用。

2)固定包被抗体和重组人Gremlin-1的浓度，确定合适的G-ap49的用量：

a)将重组人Gremlin-1加入到抗Gremlin-1抗体包被的微孔中(50ng/ml，PBS稀释)，37℃孵育1小时。弃去孔中液体，用PBST洗3次。

b)带有生物素标记的G-ap49经变性后复性，以SHMCK缓冲液稀释成100nM,50nM,25nM，加入到洗涤后的微孔中。37℃再孵育1小时。弃去微孔中液体，PBST洗3遍。

c)每孔加入HRP-streptavidin(1:2000，SHMCK稀释)100μl，37℃孵育1小时。弃去微孔中液体，PBST洗3遍，显色。

d)酶标仪波长450nm条件下进行分析。

如图7-1，固定抗体包被浓度及Gremlin-1浓度后，可见G-ap49浓度在0-100nM之间时，OD值随G-ap49浓度增加而显著增大；G-ap49浓度在100nM以后，OD值基本上不再有明显变化。因此，选择100nM的G-ap49浓度作为工作浓度，用于后续确定可检测的Gremlin-1的浓度范围。

3)固定包被抗体浓度及G-ap49的浓度(100nM)，确定可检测的重组人Gremlin-1的浓度范围。

a)将重组人Gremlin-1(100ng,50ng,25ng,12.5ng/ml，3％BSA/PBST稀释)加入到抗Gremlin-1抗体包被的微孔中，37℃孵育1小时。弃去孔中液体，用PBST洗3次。

b)带有生物素标记的G-ap49变性复性后加入到洗涤后的微孔中(100nM)。37℃再孵育1小时。弃去微孔中液体，PBST洗3遍。

c)每孔加入SHMCK稀释后的HRP-streptavidin(1:2000)100μL，37℃孵育1小时。弃去微孔中液体，PBST洗3遍后显色。

d)酶标仪波长450nm条件下进行分析。

如图7-2，当固定包被浓度及G-ap49浓度后，OD值随Gremlin-1的浓度增大而明显增加。

以上表明G-ap49可以用于基于适配子的酶联吸附试验即ELAA。

4、验证G-ap49在组织化学染色中的应用。

1)选择四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化的肝脏标本。60℃烤片1小时，梯度二甲苯及酒精脱蜡、脱水。蒸馏水冲洗切片。

2)消除过氧化物酶：将3％H2O2(PBS稀释)滴加在切片上，室温孵育约30min，PBS冲洗3遍。

3)抗原修复：将切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液(PH6.0)中，于微波炉内微波辐射95℃10分钟，待修复液降至室温后，PBS洗3次。

4)封闭：将山羊血清滴加在切片上，室温静置2小时后，弃去。

5)一抗孵育：

抗Gremlin-1抗体(1：200，PBS稀释)，同时设正常兔IgG做阴性对照；

G-ap49(400nM，PBS稀释)，同时设文库对照；

滴加在切片上，室温孵育1小时后移至4℃过夜。

6)将湿盒取出，在室温下孵育45min，用PBS洗3次，各5min。

7)二抗孵育：在滴加抗Gremlin-1抗体及正常兔IgG的切片上滴加一滴生物素标记的山羊抗兔二抗工作液，置于37℃温箱中孵育1小时。

8)用PBS洗3次，各5min。

9)在所有切片上加入辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素工作液(1:500，PBST稀释)，于37℃温箱中孵育1小时。

10)DAB染色：染色5-20min，在显微镜下观察控制染色程度。

11)用自来水充分冲洗切片，苏木精染液复染，最后脱水、透明、中性树胶固定，常规封片。

12)光学显微镜下观察切片。

如图8所示，以G-ap49及抗Gremlin-1抗体做的组织化学染色，在其纤维间隔及汇管区可见明显的阳性染色，甚至G-ap49组存在阳性染色的细胞核。而各自的对照组，文库对照及正常兔IgG对照，没有明确的阳性染色。

5、验证G-ap49在细胞化学染色中的应用

1)高糖细胞培养基DMEM中加入10％胎牛血清，100U/ml青霉素及100U/ml链霉素配制成完全培养基。盖玻片经泡酸，高温灭菌处理后置于6孔板中，加HEK293细胞培养。待细胞贴壁，汇合率达80％之后，脂质体2000用于转染重组质粒PEGFP-C2-hGremlin-1(包含EGFP-hGremlin-1的融合基因)及PEGFP-C2。转染的重组质粒分别于转染后48小时，取出细胞爬片，用4％多聚甲醛固定后进行免疫组化染色。

2)PBS洗3遍后，用0.5％曲拉通X-100(TritonX-100)孵育30min，增加细胞膜的通透性，PBS洗3遍。

3)余做法同组织化学染色。

如图9所示，经G-ap49染色后，转染PEGFP-C2-hGremlin-1重组质粒的细胞有阳性染色，转染PEGFP-C2的细胞爬片无明显阳性染色细胞，这个结果与抗Gremlin-1抗体染色结果相似。综合以上结果可知，G-ap49可以特异性的结合Gremlin-1，作用与抗体相当，可用于免疫组化染色中检测Gremlin-1的存在。

目前蛋白质的识别及检测主要以抗体为主，核酸适配子在亲和力和特异性方面可与抗体媲美，甚至优于抗体，并且具有抗体所不具备的其他一些优点：筛选周期短，能应用于大规模的工业生产；生产成本低，稳定性好，重复性强，生产中很少存在批次间的差异；没有免疫原性，没有毒性和明显的副作用；易于化学修饰，可以在合成时精确、定点连接其他功能基团和分子，如巯基、氨基和荧光素、生物素、酶或金属微粒等，解离常数(K_d)多在pmol/l-nmol/l之间。因此，核酸适配子具有更为广阔的应用前景。

综合本发明的以上结果表明，带有生物素标签的核酸适配子G-ap49可以特异性的识别重组人Gremlin-1，且具有较高的特异性及灵敏性。经过生物素标记后的核酸适配子可以应用于核酸蛋白质印迹(South-Western blotting)、基于适配子的酶联吸附试验(ELAA)、细胞及组织化学染色(Aptamer-based histochemistry and cytochemistry)。因此，G-ap49在亲和力和特异性方面可与抗体媲美，甚至优于抗体，有望被开发成为体内外检测蛋白质Gremlin-1的有力工具。