一种双标记尿嘧啶核苷‑(13C,15N2)的合成方法与流程

本发明涉及稳定同位素标记的有机化合物的制备方法，尤其涉及一种双标记尿嘧啶核苷-(¹³C,¹⁵N₂)的有机合成方法。

背景技术：

尿嘧啶核苷是白色针状结晶或粉末，无气味，味稍甜而微辛，微溶于稀醇，不溶于无水乙醇，是构成动物细胞核酸的有关成分。在生物医学研究中是不可缺少的原料，同时也是制备生物药品的基本元素。尿嘧啶核苷是一种药物，常用于治疗抗巨型红血球贫血和肝、脑血管、心血管等疾病，也是制造氟尿嘧啶(S-FC)、脱氧核苷、碘苷(IDUR)、溴苷(BUDR)、氟苷(FUDR)等药物的主要原料。

为了研究尿嘧啶核苷及其衍生物药物对生物体作用机理，需要对化合物及其代谢物进行跟踪，但是由于化合物在高噪音背景、复杂的基质效应、前处理和质谱检测器等因素的影响下，对分析方法测定结果的影响较大。为了避免分析的不准确性，使用稳定同位素标记化合物，可以有效校正方法中出现的误差，显著提高了检测方法的稳定性。双标记尿嘧啶核苷-(¹³C,¹⁵N₂)作为同位素标记物可以有效而且准确的检测核苷类药物及其代谢物。

目前，制备尿嘧啶核苷的方法有RNA化学水解法和发酵法。传统的尿嘧啶核苷制备方法是使用RNA经化学水解，然后制备2种嘧啶核苷(Kazarinova LA,Livshits VA,Preobrazhenskaya ES,et al.Method for producing uridine-5'-monophosphate by fermentation using mutantstrains of coryneform bacteria[P].United States Patent:6344344,2002-02-05)，此法不仅需要大量的优质RNA原料，而且不适用于制备同位素标记尿嘧啶核苷；发酵法(王锐.嘧啶核苷的研究进展[J].生物技术通讯,2007,18(3):539～541.)是借助于微生物具有合成自身所需核苷的能力,通过对特定微生物的诱变处理，选育出营养缺陷型及核苷类似物抗性突变株,以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏，从而达到在发酵过程中积累嘧啶核苷的目的，添加前体物发酵法是利用核苷酸生物合成途径的补救途径，通过在核苷生产菌的培养基中添加前体物尿嘧啶，使嘧啶碱基通过补救途径直接合成核苷，从而增加尿苷的生成量。发酵法具有发酵条件简单、周期短和产率高等优点，但是选育出有用的菌种较为困难，并且同位素丰度容易被稀释。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种方法简单、可行并适合批量生产的双标记尿嘧啶核苷-(¹³C,¹⁵N₂)的合成方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种双标记尿嘧啶核苷-(¹³C,¹⁵N₂)的合成方法，其特征在于，该方法以无水苯为溶剂，双标记尿素-(¹³C,¹⁵N₂)和丙炔酸为原料进行环化反应，得到双标记尿嘧啶-(¹³C,¹⁵N₂)；在Ar₂气氛下，乙腈作溶剂，双标记尿嘧啶-(¹³C,¹⁵N₂)和1-乙酰氧基-2,3,5-三苯甲酰氧基-β-D-呋喃核糖混合，接着加入六甲基二硅氮烷和三氟甲基磺酸三甲基硅脂，经后处理后得到的中间体用氨水水解，即可得到双标记尿嘧啶核苷-(¹³C,¹⁵N₂)。

所述的方法具备包括以下步骤：

(1)以无水苯为溶剂，双标记尿素-(¹³C,¹⁵N₂)和丙炔酸加入到溶剂中，20～150℃反应10～40小时，在反应过程中用分水器将水分离，将得到的深红色溶液加入到冰水中，立即有尿嘧啶的晶体析出，放置过夜，所得结晶双标记尿嘧啶-(¹³C,¹⁵N₂)过滤，真空干燥；

(2)在Ar₂气氛下，将双标记尿嘧啶-(¹³C,¹⁵N₂)和1-乙酰氧基-2,3,5-三苯甲酰氧基-β-D-呋喃核糖加入溶剂中，室温搅拌，接着放置于冰浴中冷却，用玻璃注射器先后加入六甲基二硅氮烷和三氟甲基磺酸三甲基硅脂，搅拌后溶液澄清，0～5℃搅拌10～50分钟后室温搅拌过夜；

(3)将反应液旋干溶剂，残留物纯化后，用饱和Na₂CO₃洗，有机相用无水Na₂SO₄干燥过夜，过滤，旋干溶剂后得中间体；

(4)将中间体溶于甲醇中，加入氨水，室温下溶液搅拌12～48小时进行水解，旋干后粗品用CH₃OH-CH₂Cl₂作淋洗剂过硅胶柱纯化，得无色固体即为目标产物双标记尿嘧啶核苷-(¹³C,¹⁵N₂)。

反应路线如下：

步骤(1)所述的双标记尿素-(¹³C,¹⁵N₂)和丙炔酸反应的摩尔比为1:1～2。

步骤(1)所述的双标记尿素-(¹³C,¹⁵N₂)和丙炔酸反应的摩尔比为1:1.2～1.5，反应温度为80℃反应20小时。

步骤(1)所述的放置过夜的温度为0～5℃，优选4℃。

步骤(2)所述的双标记尿嘧啶-(¹³C,¹⁵N₂)和1-乙酰氧基-2,3,5-三苯甲酰氧基-β-D-呋喃核糖反应的摩尔比为1:1～2；所述的溶剂为乙腈、二氯甲烷、氯仿中的一种或者多种；加入六甲基二硅氮烷的摩尔量为尿嘧啶-(¹³C,¹⁵N₂)的2～6倍；加入三氟甲基磺酸三甲基硅脂的摩尔量为尿嘧啶--(¹³C,¹⁵N₂)的0.5～3倍；

步骤(2)所述的双标记尿嘧啶-(¹³C,¹⁵N₂)和1-乙酰氧基-2,3,5-三苯甲酰氧基-β-D-呋喃核糖反应的摩尔比为1:1.2～1.5；所述的溶剂为乙腈；加入六甲基二硅氮烷的摩尔量为尿嘧啶-(¹³C,¹⁵N₂)的3倍；加入三氟甲基磺酸三甲基硅脂的摩尔量为尿嘧啶--(¹³C,¹⁵N₂)的2倍。

步骤(3)所述的纯化是将残留物溶解于溶剂中，采用的溶剂为乙酸乙酯、氯仿、乙醚中的一种或多种。

步骤(4)所述的氨水溶度为5％～20％，氨水水解时间为20小时。

与现有技术相比，为了可以有效而且准确地检测嘧啶核苷类药物的代谢途径，本发明采用以无水苯为溶剂，双标记尿素-(¹³C,¹⁵N₂)和丙炔酸为原料进行环化反应，粗品经脱色和重结晶后得到双标记尿嘧啶-(¹³C,¹⁵N₂)。在Ar₂气氛下，乙腈作溶剂，双标记尿嘧啶-(¹³C,¹⁵N₂)和1-乙酰氧基-2,3,5-三苯甲酰氧基-β-D-呋喃核糖搅拌混合，接着用玻璃注射器加入六甲基二硅氮烷和三氟甲基磺酸三甲基硅脂。经后处理后得到的中间体用氨水水解，即可得到双标记尿嘧啶核苷-(¹³C,¹⁵N₂)。收率≥72％(以双标记尿素-(¹³C,¹⁵N₂)计)，¹³C和¹⁵N丰度都大于98％(用Thermo的液相色谱-质谱联用仪和MAT271同位素质谱仪测定)，化学纯度大于99％(Waters液相色谱和Nicole公司的Mahna-IR550红外光谱仪测定)。此方法标记¹³C,¹⁵N₂同位素工艺简单，收率较高，同位素丰度不下降，适合实验室生产双标记尿嘧啶核苷-(¹³C,¹⁵N₂)。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

取双标记尿素-(¹³C,¹⁵N₂)10nmol和丙炔酸15nmol加入到无水苯为溶剂的溶液中，80℃反应40小时，在反应过程中用分水器将水分离，将得到的深红色溶液加入到冰水中，立即有尿嘧啶的晶体析出，4℃放置过夜。结晶双标记尿嘧啶-(¹³C,¹⁵N₂)过滤，真空干燥，得到1.01g产品(1)。

在Ar₂气氛下，以乙腈为溶剂，将10nmol尿嘧啶-(¹³C,¹⁵N₂)和20nmol 1-乙酰氧基-2,3,5-三苯甲酰氧基-β-D-呋喃核糖加入溶液中，室温搅拌，接着放置于冰浴中冷却，用玻璃注射器先后加入60nmol六甲基二硅氮烷和5nmol三氟甲基磺酸三甲基硅脂，搅拌后溶液澄清，0℃搅拌30分钟后室温搅拌过夜。

将反应液旋干溶剂，残留物溶解于乙酸乙酯，用饱和Na₂CO₃洗至pH中性，饱和NaCl洗有机相3次，有机相用无水Na₂SO₄干燥过夜。过滤，旋干溶剂后得中间体(2)。

将中间体(2)溶于甲醇中，加入10％氨水，室温下溶液氨水水解20小时，旋干后粗品用CH₃OH-CH₂Cl₂作淋洗剂过硅胶柱纯化，得到产物用正己烷洗，真空干燥后得无色固体即为目标产物双标记尿嘧啶核苷-(¹³C,¹⁵N₂)，总收率为72.5％(以双标记尿素-(¹³C,¹⁵N₂)计)，¹³C≥98％、¹⁵N≥98％、化学纯度≥99％。

实施例2

取双标记尿素-(¹³C,¹⁵N₂)10nmol和丙炔酸10nmol加入到无水苯为溶剂的溶液中，20℃反应20小时，在反应过程中用分水器将水分离，将得到的深红色溶液加入到冰水中，立即有尿嘧啶的晶体析出，4℃放置过夜。结晶双标记尿嘧啶-(¹³C,¹⁵N₂)过滤，真空干燥，得到0.86g产品(1)。

在Ar₂气氛下，以乙腈为溶剂，将10nmol尿嘧啶-(¹³C,¹⁵N₂)和13nmol 1-乙酰氧基-2,3,5-三苯甲酰氧基-β-D-呋喃核糖加入溶液中，室温搅拌，接着放置于冰浴中冷却，用玻璃注射器先后加入30nmol六甲基二硅氮烷和10nmol三氟甲基磺酸三甲基硅脂，搅拌后溶液澄清，0℃搅拌30分钟后室温搅拌过夜。

将反应液旋干溶剂，残留物溶解于乙酸乙酯，用饱和Na₂CO₃洗至pH中性，饱和NaCl洗有机相3次，有机相用无水Na₂SO₄干燥过夜。过滤，旋干溶剂后得中间体(2)。

将中间体(2)溶于甲醇中，加入20％氨水，室温下溶液氨水水解12小时，旋干后粗品用CH₃OH-CH₂Cl₂作淋洗剂过硅胶柱纯化，得到产物用正己烷洗，真空干燥后得无色固体即为目标产物双标记尿嘧啶核苷-(¹³C,¹⁵N₂)，总收率为73.0％(以双标记尿素-(¹³C,¹⁵N₂)计)，¹³C≥98％、¹⁵N≥98％、化学纯度≥99％。

实施例3

取双标记尿素-(¹³C,¹⁵N₂)10nmol和丙炔酸20nmol加入到无水苯为溶剂的溶液中，150℃反应10小时，在反应过程中用分水器将水分离，将得到的深红色溶液加入到冰水中，立即有尿嘧啶的晶体析出，4℃放置过夜。结晶双标记尿嘧啶-(¹³C,¹⁵N₂)过滤，真空干燥，得到1.00g产品(1)。

在Ar₂气氛下，以乙腈为溶剂，将10nmol尿嘧啶-(¹³C,¹⁵N₂)和10nmol 1-乙酰氧基-2,3,5-三苯甲酰氧基-β-D-呋喃核糖加入溶液中，室温搅拌，接着放置于冰浴中冷却，用玻璃注射器先后加入20nmol六甲基二硅氮烷和30nmol三氟甲基磺酸三甲基硅脂，搅拌后溶液澄清，0℃搅拌30分钟后室温搅拌过夜。

将反应液旋干溶剂，残留物溶解于乙酸乙酯，用饱和Na₂CO₃洗至pH中性，饱和NaCl洗有机相3次，有机相用无水Na₂SO₄干燥过夜。过滤，旋干溶剂后得中间体(2)。

将中间体(2)溶于甲醇中，加入5％氨水，室温下溶液氨水水解48小时，旋干后粗品用CH₃OH-CH₂Cl₂作淋洗剂过硅胶柱纯化，得到产物用正己烷洗，真空干燥后得无色固体即为目标产物双标记尿嘧啶核苷-(¹³C,¹⁵N₂)，总收率为73.5％(以双标记尿素-(¹³C,¹⁵N₂)计)，¹³C≥98％、¹⁵N≥98％、化学纯度≥99％。

实施例4

取双标记尿素-(¹³C,¹⁵N₂)10nmol和丙炔酸12nmol加入到无水苯为溶剂的溶液中，100℃反应20小时，在反应过程中用分水器将水分离，将得到的深红色溶液加入到冰水中，立即有尿嘧啶的晶体析出，0℃放置过夜。结晶双标记尿嘧啶-(¹³C,¹⁵N₂)过滤，真空干燥，得到1.00g产品(1)。

在Ar₂气氛下，以二氯甲烷为溶剂，将10nmol尿嘧啶-(¹³C,¹⁵N₂)和12nmol 1-乙酰氧基-2,3,5-三苯甲酰氧基-β-D-呋喃核糖加入溶液中，室温搅拌，接着放置于冰浴中冷却，用玻璃注射器先后加入30nmol六甲基二硅氮烷和20nmol三氟甲基磺酸三甲基硅脂，搅拌后溶液澄清，5℃搅拌10分钟后室温搅拌过夜。

将反应液旋干溶剂，残留物溶解于氯仿，用饱和Na₂CO₃洗至pH中性，饱和NaCl洗有机相3次，有机相用无水Na₂SO₄干燥过夜。过滤，旋干溶剂后得中间体(2)。

将中间体(2)溶于甲醇中，加入10％氨水，室温下溶液氨水水解24小时，旋干后粗品用CH₃OH-CH₂Cl₂作淋洗剂过硅胶柱纯化，得到产物用正己烷洗，真空干燥后得无色固体即为目标产物双标记尿嘧啶核苷-(¹³C,¹⁵N₂)，总收率为73.8％(以双标记尿素-(¹³C,¹⁵N₂)计)，¹³C≥98％、¹⁵N≥98％、化学纯度≥99％。

实施例5

取双标记尿素-(¹³C,¹⁵N₂)10nmol和丙炔酸16nmol加入到无水苯为溶剂的溶液中，110℃反应30小时，在反应过程中用分水器将水分离，将得到的深红色溶液加入到冰水中，立即有尿嘧啶的晶体析出，10℃放置过夜。结晶双标记尿嘧啶-(¹³C,¹⁵N₂)过滤，真空干燥，得到1.00g产品(1)。

在Ar₂气氛下，以氯仿为溶剂，将10nmol尿嘧啶-(¹³C,¹⁵N₂)和15nmol 1-乙酰氧基-2,3,5-三苯甲酰氧基-β-D-呋喃核糖加入溶液中，室温搅拌，接着放置于冰浴中冷却，用玻璃注射器先后加入30nmol六甲基二硅氮烷和20nmol三氟甲基磺酸三甲基硅脂，搅拌后溶液澄清，0℃搅拌30分钟后室温搅拌过夜。

将反应液旋干溶剂，残留物溶解于氯仿，用饱和Na₂CO₃洗至pH中性，饱和NaCl洗有机相3次，有机相用无水Na₂SO₄干燥过夜。过滤，旋干溶剂后得中间体(2)。

将中间体(2)溶于甲醇中，加入15％氨水，室温下溶液氨水水解36小时，旋干后粗品用CH₃OH-CH₂Cl₂作淋洗剂过硅胶柱纯化，得到产物用正己烷洗，真空干燥后得无色固体即为目标产物双标记尿嘧啶核苷-(¹³C,¹⁵N₂)，总收率为74％(以双标记尿素-(¹³C,¹⁵N₂)计)，¹³C≥98％、¹⁵N≥98％、化学纯度≥99％。