一种阿维菌素高产菌株及其筛选方法与流程

本发明涉及一种用于生产抗生素的菌株及其筛选方法，具体地说是一种阿维菌素高产菌株及其筛选方法。

背景技术：

阿维菌素(Avermectins，AVM)，又称阿佛曼菌素，是由阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)发酵产生的一组大环内酯类抗生素。阿维菌素因具有杀虫、杀螨、杀线虫功效而广泛用于治疗多种家畜体内、外寄生虫病，阿维菌素包括结构不同的8种同系物，即4个主要组分(Ala、A2a、B1a和B2a)和4个次要组分(A1b、A2b、B1b和B2b)，其中，B1组分活性最大，尤其以B1a的驱虫效果最强。

阿维菌素作用机制较为特殊，不易使害虫产生抗性，主要通过作用于昆虫外周神经系统内的γ-氨基丁酸(GABA)受体和谷氨酸门控的氯离子通道致使昆虫麻痹、死亡，由于哺乳动物以γ-氨基丁酸介导的神经位于中枢神经系统，阿维菌素不容易通过血脑屏障进入中枢神经系统，故而具有高选择性和高安全性，在常用剂量下，对人、畜安全，不伤害天敌，不破坏生态。阿维菌素因具有结构新颖、高效、广谱、低残留和对人畜及环境安全等这些优点，而成为一种重要的绿色生态型抗生素，同时作为人类医药、农药和兽药的原料，其被称为“三位一体”的药物，具有良好的市场前景。

阿维菌素的生产一直以提高发酵单位，降低生产成本为主要目标，现有阿维菌素生产菌株的发酵性能不太理想，为进一步适应工业生产需求，需要对发酵菌种进行改良。诱变育种是获得高产工业菌株的途径之一，然而通过一次诱变处理或单一的诱变手段难以得到高产稳定的菌株，且诱变菌株的筛选工作量大，采用传统的摇瓶发酵培养法不仅费时费力，成本较高，而且筛选量受限，各处理平行度和筛选效果也不理想。

技术实现要素：

本发明的目的就是提供一种阿维菌素高产菌株，同时提供一种该菌株的筛选方法，以解决阿维菌素生产过程中菌种发酵能力低以及传统菌株筛选方法效率低、筛选量小的问题。

为了实现本发明的目的，本发明提供了一种阿维菌素高产菌株，该菌株为阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)AV-185S，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12215，保藏日期为2016年3月15日。

本发明所提供的阿维菌素高产菌株AV-185S的筛选方法，具体包括以下步骤：

a、孢子悬浮液制备：将阿维链霉菌出发菌株的孢子制成孢子悬浮液，调整孢子浓度为10⁶-10⁷个/mL；

b、紫外线复合氯化锂诱变处理：对孢子悬浮液进行紫外线诱变处理，将诱变后的孢子悬浮液系列稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，取0.1mL各浓度的稀释液，涂布在含氯化锂的固体双碟培养基上，在温度28±1℃，湿度70±5％条件下培养9天；

c、制备阿维链霉菌液体培养基：所述液体培养基包括：糊精90-110g/L、酵母水解物20-26g/L、麦芽抽提物2-5g/L、牛肉膏10-15g/L、氯化钴0.01-0.03g/L、硫酸锰0.001-0.003g/L、钼酸钠0.001-0.003g/L，液体培养基pH值为7.4-7.6，将配好的液体培养基分装于深孔板中灭菌备用；

d、深孔板液体培养筛选高产菌株：选取步骤b中灰色饱满的单菌落，用牙签蘸取菌落孢子点种于普通固体双碟培养基上进行培养，且同时对应的点种于深孔板液体培养基中，将深孔板盖好透气不透水的板盖后置于旋转式摇床进行培养；

e、菌株发酵效价的检测：深孔板液体培养结束后，用乙醇提取培养液中的阿维菌素，用酶标仪检测提取液OD值，选取OD值高的提取液用HPLC检测其效价，将效价最高的提取液对应的固体双碟中的菌株保藏，即为阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)AV-185S。

步骤b中，所述紫外线诱变处理为：将孢子悬浮液置于15W紫外灯下，距离30厘米处黑暗处理25秒；所述固体双碟培养基的氯化锂含量为0.3wt％。

步骤d中深孔板培养条件为：液体培养基量为每孔2-3mL，摇床转速为200±20rpm，培养温度为28±1℃，湿度为70±5％，培养周期为6-8天。

本发明的另一方面，提供了一种适用于深孔板发酵筛选阿维菌素高产菌株的液体培养基，所述液体培养基包括：糊精90-110g/L、酵母水解物20-26g/L、麦芽抽提物2-5g/L、牛肉膏10-15g/L、氯化钴0.01-0.03g/L、硫酸锰0.001-0.003g/L、钼酸钠0.001-0.003g/L，液体培养基pH值为7.4-7.6。

所述液体培养基配制时，糊精单独糊化后，再加入其它原料混和均匀。

本发明所提供的AV-185S菌株是一株阿维菌素高产菌株，该菌株摇瓶培养的平均效价为6842.8ug/mL，比出发菌株提高了26.4％；本发明使用深孔板液体培养和酶标仪检测法实现了菌株的高通量筛选，同时，本发明优化了深孔板液体发酵的培养基和培养条件，使菌株效价有了显著提高。

附图说明

图1是本发明菌株的固体双碟菌落形态图。

图2是本发明菌株培养液的HPLC检测图谱。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步说明本发明的内容。

所用原料未提及来源的为市售产品。

实施例1：本发明液体培养基的深孔板发酵

1、液体培养基的制备：糊精100g、酵母水解物24.1g、麦芽抽提物3.1g、牛肉膏13.1g、氯化钴0.002g、硫酸锰0.002g、钼酸钠0.002g，配制时，糊精单独糊化，然后加入其他原料，最后加饮用水定容至1000mL，pH值7.4-7.6。将配好的液体培养基分装于24孔板中，盖好板盖，置于筐中，121℃灭菌30min备用。

2、将菌株AV-185S的孢子用牙签点种于装有3mL液体培养基的24孔深孔板中，接种完毕后，盖上板盖，将孔板固定于摇床固定板上，转速200rpm，温度28℃，环境相对湿度70±5％条件下，培养6天。

3、6天之后取下液体深孔板，用多孔道移液枪取发酵液0.2mL，加3.8mL乙醇，盖紧盖子(其中加密封硅胶垫)，于振荡器上振荡提取30min，孔板离心机离心2500rpm，离心10min，将上清液再稀释20倍后，用酶标仪检测246nm下的光吸收，用HPLC检测其效价。

对比例1：生产对照培养基的深孔板发酵

1、生产对照培养基的制备：淀粉120g、淀粉酶0.18g、高温黄豆饼粉0.9g、酵母粉2.2g、豆粕13.1g、花生粕24.1g、氯化钴0.02g、硫酸锰0.002g。配制时先称淀粉和淀粉酶，加入适量饮用水，搅拌均匀，然后边加热边搅拌，将淀粉液化成均一的半透明状态，然后将其它物料溶解后和淀粉液一起定容至1000mL。将配好的生产对照培养基分装于24孔板中，盖好板盖，置于筐中，121℃灭菌30min备用。

2、将上述生产对照培养基取代实施例1中的液体培养基，其他原料用量和方法与实施例1相同，检测得到生产对照培养基的孔板效价。

本发明对应用于深孔板液体培养的培养基和培养条件进行了优化，通过实施例1和对比例1的试验可知，实施例1所得培养液效价为2695.6ug/ml，变异系数1.2，对比例1所得培养液效价为2067.2ug/ml，变异系数为2.8。本发明所提供的经筛选后的培养基配方发酵效价比对照培养基提高了30.4％，变异系数降低了42.9％，在效价和数据稳定性上均优于对照培养基。经过试验本发明最终得出较佳的液体培养基配方和培养条件如下：

所述液体培养基包括：糊精90-110g/L、酵母水解物20-26g/L、麦芽抽提物2-5g/L、牛肉膏10-15g/L、氯化钴0.01-0.03g/L、硫酸锰0.001-0.003g/L、钼酸钠0.001-0.003g/L，液体培养基pH值为7.4-7.6。将配好的液体培养基分装于24孔板中，盖好板盖，置于筐中，121℃灭菌30min备用。液体培养基配制时，糊精单独糊化后，再加入其它原料混和均匀。24孔深孔板及板盖为上海甘微生物技术公司提供，板盖具有透气不透水的功能，达到发酵需氧的条件。

所述培养条件为：旋转式摇床培养，液体培养基量为每孔2-3mL，摇床转速为200±20rpm，培养温度为28±1℃，湿度为70±5％，培养周期为6-8天。

实施例2：

1、固体培养基的制备：葡萄糖15g、牛肉膏3g、天门冬酰胺0.5g、磷酸二氢钾0.5g、琼脂19g，加饮用水溶解定容至1000mL，pH值7.2-7.5，121℃灭菌30min。使用时先融化，然后倒出约30mL于双碟中，凝固后备用。

2、液体培养基的制备：同实施例1。

3、出发菌株的分离验证培养：本发明所用出发菌株为来自华北制药集团爱诺有限公司实验室的阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)(编号为：2015-45-38)，取出发菌株成熟孢子制成孢子悬浮液，调整孢子浓度为10⁶-10⁷个/mL，将孢子悬浮液系列稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，取0.1mL各浓度的稀释液，涂布于固体双碟培养基上进行培养，培养温度为28±1℃，湿度为70±5％，时间为9天；然后选取固体双碟上灰色饱满的菌落，用牙签蘸取菌落孢子点种于固体双碟培养基上进行培养，且同时对应的点种于装有3mL液体培养基的24孔深孔板中，接种完毕后，盖上板盖，将孔板固定于摇床固定板上，转速180rpm，温度28℃，环境相对湿度70±5％条件下，培养6天，点种固体双碟菌落培养12天。

6天之后取下液体深孔板，用多孔道移液枪取发酵液0.2mL，加3.8mL乙醇，盖紧盖子(其中加密封硅胶垫)，于振荡器上振荡提取30min，孔板离心机离心2500rpm，离心10min，将上清液再稀释20倍后，用酶标仪检测246nm下的光吸收。将OD值高的提取液用HPLC检测其效价。从试验中选取列举100株效价较高的菌株，其检测效价和OD值如表一所示。

表一

由表一可以看出，本发明的深孔板液体培养法适用于出发菌株的培养发酵，所得培养液中的阿维菌素达到了可检测水平，且实验结果较为稳定，平行性好，OD值和效价检测结果具有一致性。

实施例3：高产菌株的筛选

1、固体培养基的配制：葡萄糖15g、牛肉膏3g、天门冬酰胺0.5g、磷酸二氢钾0.5g、琼脂19g，加饮用水溶解定容至1000mL，pH值7.2-7.5，121℃灭菌30min。配制10wt％氯化锂溶液，并用无菌膜过滤除菌后备用。取氯化锂溶液与固体培养基混合，配制成氯化锂终浓度为0.3wt％的固体培养基，使用时先融化，然后倒出约30mL于双碟中，凝固后备用。

2、液体培养基的制备同实施例1。

3、取出发菌株成熟孢子制成孢子悬浮液，调整孢子浓度为10⁶-10⁷个/mL；将孢子悬浮液置于15W紫外灯下，距离30厘米处黑暗处理25秒，将诱变后的孢子悬浮液系列稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，取0.1mL各浓度的稀释液，涂布在含0.3wt％氯化锂的固体双碟培养基上，在温度28±1℃，湿度70±5％条件下培养9天；然后选取固体双碟培养基上灰色饱满的菌落，用牙签蘸取菌落孢子点种于普通固体双碟培养基上进行培养，且同时对应的点种于装有2mL液体培养基的24孔深孔板中，接种完毕后，盖上板盖，将孔板固定于摇床固定板上，转速220rpm，温度28℃，环境相对湿度70±5％条件下，培养6天，点种固体双碟菌落培养12天。

6天之后取下液体深孔板，用多孔道移液枪取发酵液0.2mL，加3.8mL乙醇，盖紧盖子(其中加密封硅胶垫)，于振荡器上振荡提取30min，孔板离心机离心2500rpm，离心10min，将上清液再稀释20倍后，用酶标仪检测246nm下的光吸收。将OD值高的提取液用HPLC检测其效价，从大量筛选试验中选取列举100株效价较高的菌株，其检测效价和OD值如表二所示。

表二

由表二可知，菌株编号为3-185(序号为39)的菌株效价最高，此菌株B1效价为2436.4ug/mL，其HPLC检测图谱如图2所示。将该菌株对应的固体双碟培养基上的菌落孢子进行保藏，菌株保藏方法为经真空冷冻干燥后存于温度-196℃条件下，之后对该菌株进行摇瓶验证试验。

4、摇瓶验证：将菌株3-185(序号为39)和出发菌株在摇瓶上进行筛选效果的确认，菌株3-185(序号为39)三次发酵8天的平均效价达到6842.8u/ml，比出发菌株提高了26.4％。将菌株3-185(序号为39)命名为AV-185S，该菌株的菌落形态如图1所示，该菌株菌落呈圆形、灰色饱满，表面有褶皱，气生菌丝发白绒粉状，孢子丰富。将AV-185S菌株进行保藏，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12215，保藏日期为2016年3月15日。