猪ApoE基因敲除打靶载体及其构建方法和应用与流程

文档序号:11126097阅读:1596来源:国知局
猪ApoE基因敲除打靶载体及其构建方法和应用与制造工艺

本发明涉及基因工程技术领域,具体地说,涉及一种猪ApoE基因敲除打靶载体及其构建方法和应用。



背景技术:

基因打靶技术的主要原理是外源DNA序列与受体细胞内染色体上同源的DNA序列之间可以发生同源重组,该技术可以对基因组进行定点的精细修饰。自2000年首例体细胞基因打靶克隆羊诞生之后,体细胞基因打靶技术结合核移植技术被广泛应用于对大动物基因组进行定点的精细修饰。

载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)是一种多态性蛋白,参与脂蛋白的转化与代谢过程,载脂蛋白E主要存在于CM、VLDL、IDL和部分HDL中,正常人血浆ApoE浓度为0.03~0.05g/L。ApoE的浓度与血浆甘油三酯含量呈正相关。ApoE与个体血脂水平与动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)发生发展密切相关。

小鼠、大鼠食性与人相近,成本低,是主要动物模型之一,然而他们对外源性胆固醇吸收率低,难致As病变。特别是小鼠的颈动脉和冠状动脉过小造成了取材的困难,且血液动力学指标和人的极不相同,很难真正模拟人类的病理过程。

兔虽然对外源性胆固醇吸收率高,肝内低密度脂蛋白(LDL)含量高,但是肝脏合成的载脂蛋白与人类不同。同时家兔食饵性As模型,常出现全身性的脂质沉积,导致动物在实验过程中时常死亡,给研究带来了不必要的损失。

非人灵长类动物,如大猩猩等、进化程度与人类接近;有些品系对胆固醇敏感;有些能自发As。但As的发生位置多样;试验费用昂贵和实验操作困难;且涉及伦理问题,给研究带来不便。

由于心血管系统在解剖学和生理学上与人的相似性,猪被广泛应用于心血管系统的手术操作和机理研究。包括在介入性导管装置的测试、心肌梗死、冠状动脉血流、心脏电生理和心血管外科方面的研究等。目前公认猪是动脉硬化研究的首选动物,因此与人类相似性极高的小型猪动脉硬化疾病模型的构建显得尤其重要。

因此,亟待开发一种对ApoE进行基因打靶的载体,并利用该载体构建小型猪动脉硬化疾病模型,从而为开展动脉粥样硬化病理研究、药物筛选、药效评价等研究提供支持。



技术实现要素:

本发明的目的是提供一种猪ApoE基因敲除打靶载体及其构建方法。

本发明的另一目的是提供所述打靶载体在制备猪ApoE基因敲除动物模型中的应用。

为了实现本发明目的,本发明提供一种猪ApoE基因敲除打靶载体,所述打靶载体是以载体pLoxPneo作为骨架载体,所述打靶载体上包括正筛选元件、负筛选标记基因以及猪ApoE基因的5’同源臂和3’同源臂;

其中,所述正筛选元件包括顺次连接的重组酶识别序列-正筛选标记基因-重组酶基因-重组酶识别序列;

所述正筛选元件的一端与所述猪ApoE基因的3’同源臂连接,另一端与所述猪ApoE基因的5’同源臂连接;在所述猪ApoE基因的3’同源臂的外侧连接有负筛选标记基因。

本发明在构建的基因打靶载体时,采用的是正负筛选策略,因此能够很大程度上排除随机整合的细胞,提高打靶细胞富集效率。

通过在正筛选基因两侧引入重组酶识别序列,以方便后续的标记基因的删除。

本发明涉及的正筛选标记基因包括编码新霉素磷酸转移酶(neo)、潮霉素B磷酸转移酶(hph)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)或嘌呤霉素乙酰转移酶(puro)等的基因;优选的,所述正筛选标记基因为neo。

本发明涉及的负筛选基因是编码白喉毒素(DTA)或胸腺去氧核苷等的基因;优选的,所述负筛选基因为DTA。

本发明涉及的重组酶基因包括编码Cre酶或Flp酶的基因;优选的,所述重组酶基因为带有tACE特异性启动子的Cre基因。

优选地,所述正筛选元件为loxP-Neo-Cre-loxP。

本发明涉及的猪ApoE基因的5’同源臂和3’同源臂的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。

在本发明的一个具体实施方式中,构建的打靶载体其完整的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明还提供所述猪ApoE基因敲除打靶载体的构建方法,包括以下步骤:

S1、通过酶切连接的方法,在载体pLoxPneo(即ploxp)中引入负筛选标记基因,得到载体ploxp-1;

S2、以猪基因组DNA为模板,设计PCR引物,分别扩增得到猪ApoE基因的5’同源臂和3’同源臂;将PCR扩增产物分别连接至pEASY-T载体中,然后进行测序;

S3、将测序正确的5’同源臂和3’同源臂,采用酶切连接的方法依次连接至载体ploxp-1上,得到载体ploxp-2;

S4、将正筛选元件引入载体ploxp-2中,即构建得到猪ApoE基因敲除打靶载体。

在本发明的一个具体实施方式中,S4是利用基因抓捕技术将带有特异性启动子的Cre基因导入标记基因中,完成整个打靶载体的构建。该技术效率高、操作简单、不依赖酶切连接,提高了基因打靶载体构建的效率。

本发明还提供所述打靶载体在制备猪ApoE基因敲除动物模型中的应用。

将所述打靶载体转染猪胎儿成纤维细胞,通过正负筛选获得中靶的阳性克隆细胞系,以所述阳性克隆细胞系为核移植供体细胞,成熟的猪卵母细胞为核移植受体细胞,通过体细胞核移植技术获得克隆胚胎;将克隆胚胎移入发情期的受体母猪子宫内妊娠,获得ApoE基因敲除F0代猪,将所得F0代猪进行杂交繁育,获得的纯合子作为猪ApoE基因敲除动物模型。

本发明进一步提供一种猪ApoE基因敲除前体细胞系,用上述构建的猪ApoE基因敲除打靶载体转染猪胎儿成纤维细胞,获得的中靶阳性细胞克隆,即为猪ApoE基因敲除前体细胞系。

通过含有与正筛选标记基因相应药物的培养基筛选得到阳性细胞。

其中,用于鉴定中靶阳性细胞克隆的特异性PCR引物包括:

SARM-S-F:5’-GGCTTTGGTTCCAGAGTTCACAGTC-3’

CRE-NHE1-R:

5’-TTCGAGAACTGCTAGCGGATCTCGGGGCAAGACAAATGTC-3’。

利用本发明方法成功获得了健康存活的ApoE基因敲除的纯合子小型猪,为心血管疾病的新药创制奠定基础,同时为开展病理研究、药物筛选、药效评价等提供保障。

附图说明

图1为本发明实施例1中猪ApoE基因敲除打靶载体ApoE KO II(即pAPOEKO-NEO-CRE-DTA-AMP)的构建流程图。

图2为本发明实施例1中打靶载体ApoE KO II的酶切鉴定结果。

图3为本发明实施例3中ApoE基因敲除克隆猪的PCR(A)和Southern Blot(B)鉴定结果;A中1-6为ApoE基因敲除的克隆猪,PCR扩增得到5kb大小的条带;B中1-6为ApoE基因敲除克隆猪,能够杂交到7kb和5.3kb大小的条带,野生型猪(WT)只能得到7kb的条带。

图4为本发明实施例3中ApoE基因敲除杂合子克隆猪的血脂测定的统计结果;其中,TG:胆固醇;TC:甘油三酯;HDL-C:高密度脂蛋白;LDL-C:低密度脂蛋白。

图5为本发明实施例3中利用Western Blot检测了基因打靶克隆猪杂合子以及纯合子的血清中ApoE蛋白的表达水平。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例均按照常规实验条件,如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001),或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1猪ApoE基因敲除打靶载体的构建

包括以下步骤:

第一步:通过酶切-连接的方法,改造打靶载体pLoxPneo(即ploxp),引入负筛选基因DTA,得到载体ploxp-DTA。

第二步:利用高保真PCR方法以小型猪的基因组DNA为模板,扩增2.4kb的片段作为5’同源臂,同时扩增一段5.7kb的片段作为3’同源臂,将PCR产物连接至T载体中测序,5’同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,3’同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

扩增5’同源臂的引物序列如下(5′-3′):

SARM-F:GAATTCAGGCTTTGGTTCCAGAGTTCACAG

SARM-R:GTCGACAGGCAACAACGCATTAGAAACAG

其中,下划线分别为EcoRI和SalI酶切位点;

扩增3’同源臂的引物序列如下(5′-3′):

LARM-F:GCGGCCGCACCAGGGAACTCCATCCTTTCTAACTCTG

LARM-R:GCGGCCGCGTGAGACTCCAGGGATGGTAAAGGAG

其中,下划线为NotI酶切位点。

第三步:在获得正确的5’同源臂和3’同源臂之后,采用酶切-连接的方法先后将5’同源臂和3’同源臂连接至载体ploxp-DTA上,得到重组载体ApoE KO。

第四步:利用基因抓捕技术将带有特异性启动子的Cre基因导入载体ApoE KO中,完成整个打靶载体的构建,将构建得到的猪ApoE基因敲除打靶载体命名为ApoE KO II(即pAPOEKO-NEO-CRE-DTA-AMP,SEQ ID NO:3)。打靶载体ApoE KO II的构建流程见图1,酶切鉴定结果见图2。

实施例2猪胎儿成纤维细胞转染及细胞筛选与鉴定

采用德国Lonza公司生产的核酸转染仪,将3μg经过线性化的打靶载体ApoE KO II转入猪胎儿成纤维细胞中。

细胞转染48h后,胰酶消化法将细胞从T75细胞培养瓶中消化下来,每100mm细胞培养皿接4×105个细胞,并用G418浓度为500μg/mL的细胞培养基筛选细胞7-9天。

用细胞克隆环将具有G418抗性的细胞克隆点挑选出来接种到48孔细胞培养板中,待细胞培养至80%汇合,胰酶消化后,接种到12孔细胞培养板中继续培养,原来48孔细胞培养板中的未被消化下来的细胞也继续培养以供提取细胞基因组DNA,之后细胞继续培养至长满6孔板的一孔,采用PCR扩增的方法对细胞克隆点进行鉴定。

PCR引物序列如下:

SARM-S-F:5’-GGCTTTGGTTCCAGAGTTCACAGTC-3’

CRE-NHE1-R:

5’-TTCGAGAACTGCTAGCGGATCTCGGGGCAAGACAAATGTC-3’

PCR扩增体系如下:

PCR程序如下:95℃3min;94℃30s,60℃30s,72℃270s,35个循环;72℃5min;4℃∞。

经鉴定,得到3个阳性细胞克隆点。细胞筛选结果以及中靶效率统计见表1。

表1细胞转染以及基因打靶效率统计结果

注:黑3代表小黑猪3号细胞系,黑4代表小黑猪3号细胞系,CEPEF3代表小型猪3号细胞系,CEPEF6代表小型猪6号细胞系,11PB5-2代表小型猪5-2号细胞系,11PB5-3代表小型猪5-3号细胞系。

实施例3转基因克隆猪纯合子的生产与鉴定

1、转基因克隆猪的生产

1)猪卵母细胞体外成熟:从屠宰场取卵巢,放入28℃-35℃含青霉素和硫酸链霉素的生理盐水中,2小时内运回实验室,用配有18号针头的20毫升注射器抽吸卵巢上直径3-6毫米的卵泡,将抽取液放于50毫升离心管中,37℃水浴中静置15分钟,去上清,加入HEPES重悬沉淀,再静置15分钟,重复一次,将重悬液放入直径60毫米的塑料培养皿中,在体式显微镜下,用口吸管挑选卵丘包裹2层以上、致密、胞质均匀的卵丘细胞-卵母细胞复合体,用成熟培养液洗涤3遍,转入在培养箱中至少已经平衡4小时的培养液滴内(每100微升液滴放25枚);每一直径35毫米的塑料培养皿中做4个液滴,用胚胎级矿物油覆盖,将卵丘细胞-卵母细胞复合体先在成熟培养液中培养20±2小时,然后转移到无hCG以及eCG的成熟液中继续培养20±2小时。

2)供体体细胞的准备:将经过鉴定为阳性的细胞克隆铺到6孔板进行培养,待其生长至80%汇合时,进行血清饥饿处理,即将培养液中的FBS浓度从20%降至0.5%继续培养2-5天,按常规方法消化,离心洗涤,最后加1毫升显微操作液重悬细胞沉淀备用。

3)受体卵母细胞去核以及供体细胞核移植:利用盲吸法进行成熟卵母细胞去核,即成熟40-44小时的猪卵母细胞,脱卵丘后选择胞质均匀、卵周隙清晰、胞膜完整的卵母细胞放入无Ca2+、Mg2+、HEPES的NCSU-23缓冲液中备用,转移到显微操作液滴内(核移植前1小时制备,直径60毫米的细胞培养皿盖中央,液滴50-80微升、2-3毫米宽、8-10毫米长、石蜡油覆盖),作用15-30分钟,将供体细胞以及成熟卵母细胞同时转入其中于39℃、5%CO2、100%湿度平衡15分钟,安装显微固定管以及去核/注射针,调节好操作系统位置在装配有显微操作仪及恒温台的倒置显微镜下,40倍显微镜下用固定管(内径25-35微米,外径100-120微米)吸持卵母细胞,用内径15-25微米的去核/注射针拨动卵母细胞,使第一极体处于钟表1点钟位置,200倍显微镜下,从钟表3点处将去核/注射针刺过透明带,吸出第一极体及其附近少许细胞质,退出去核/注射针,将第一极体以及少许胞质吐出,挑选直径15-20微米、折光性强、圆形、光滑的体细胞,200倍显微镜下用去核/注射针吸取一个供体细胞,从去核进针处将体细胞注射到透明带下的卵周隙内,用注射针点压透明带,使供体细胞与受体卵胞质的细胞膜彼此紧密接触,每批25-30个卵母细胞,构建完成后将供体细胞-卵胞质构成的细胞对(重构卵)转移到含有4mg/mlBSA的NCSU-23培养液中,39℃、5%CO2、100%湿度培养箱中修复1-2小时。

4)重构胚融合与激活:将恢复好的重构卵分批转移到融合液中平衡3分钟,用融合/激活液洗涤3遍后,每批5个放入已经铺满融合液的融合槽内,用拉制的且尖端很细的实心玻璃针拨动重组卵,使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行,用ECM2001融合仪施加一个30μs,2.0kv/cm的直流电脉冲诱导融合同时激活,用含有4mg/ml BSA的NCSU-23%洗涤5遍,立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中,39℃、5%CO2、100%湿度培养0.5~1小时后取出,在体视显微镜下判定融合。

5)囊胚发育:在开始显微操作前至少4小时预先做好培养液滴:在超净台内取35毫米培养皿,做6-8个30微升大的液滴,小心加入2.5-3毫升矿物油覆盖,做好标记后放入CO2培养箱内平衡将上述融合的重构胚用胚胎培养液洗涤5遍后转入30微升的液滴,每个液滴培养8-10个重构胚。

6)胚胎移植:挑选自然发情母猪,将在CO2养箱中培养12-30小时的1-2细胞期的克隆胚取出,装入2.5毫升细管内,用灭菌的锡箔纸包装好,做好标记,放到恒温运输箱中运到猪移植地点,用40-60毫升(1mg/100kg体重)生理盐水溶解1-1.5毫克硫喷妥钠和地西泮,耳静脉注射20毫升,待受体猪初步麻倒后,将其抬到手术架上仰卧(青年后备母猪)或者侧卧(经产母猪),用绳子绑定,对后备母猪,在腹部下面第1对和第2对乳头之间,腹中线局部15×10cm2面积内清洁刮毛,先碘酒消毒,后酒精棉脱碘(对经产母猪,在腹部肷窝部15×10cm2的范围内清洁,刮毛,碘酒消毒后酒精脱碘)在准备动刀切开腹中线之前,将前面余下的麻醉药再酌情注射20-30毫升,沿腹中线切开一个长约8-10厘米的口,打开腹腔,探进去一只手,取出卵巢后用润湿的灭菌脱脂纱布盖上(对经产母猪:沿侧腹部做一个与腹中线面垂直的长约10厘米的切口),在手术人员即将取出卵巢,调整好输卵管伞之际,将装在吸管内的胚胎取出放在热台上,体视显微镜下将胚胎装入移植管内,手术人员和胚胎移植人员相互协调,将移植管从输卵管伞部探入输卵管至少5厘米,大致到了壶腹-峡部结合处,一边推动注射器,以便外撤移植管,移植后体视镜下观察胚胎是否仍滞留在移植管内,确认没有后,开始卵巢回位,术口缝合,胚胎移植后第10天肌肉注射800IU的hCG,13天注射500IU的PMSG。

2、ApoE基因敲除打靶克隆杂合子猪的分子鉴定

用PCR和Southern Blot的方法对6头出生的单敲除打靶克隆猪进行基因型鉴定,PCR鉴定方法如实施例2所述,Southern Blot所用的探针为同源断臂上的一段序列,实验结果表明,该6头均为ApoE基因单敲除阳性猪,结果如图3所示。

3、ApoE基因敲除打靶杂合子克隆猪的血脂检测

为了检测ApoE基因敲除打靶杂合子克隆猪个体是否会引起动脉硬化相关疾病变化,本发明检测了部分杂合子个体的血清水平,检测结果初步表明杂合子克隆猪个体血脂四项并无显著性差异(图4),可能杂合子个体由于补偿作用导致表现不明显。进一步实验需要获得双敲除纯合子个体。

4、基因敲除打靶杂合子以及纯合子克隆猪的ApoE蛋白表达水平检测

本发明利用Western Blot检测了基因打靶克隆猪杂合子以及纯合子的血清中ApoE蛋白的表达水平。在转基因克隆猪杂合子(ApoE+/-)的血清中仍然能够检测到ApoE蛋白的表达,而在ApoE敲除纯合子(ApoE-/-)中,血清中检测不到ApoE蛋白的表达,结果如图5所示。

虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。

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