AaDBR2基因启动子DBR2pro1及其用途的制作方法

文档序号:11126041阅读:661来源:国知局
AaDBR2基因启动子DBR2pro1及其用途的制造方法与工艺
本发明涉及一种在植物分泌性腺毛特异性表达的启动子及其用途,具体地涉及一种AaDBR2基因启动子DBR2pro1及其用途。
背景技术
:青蒿(ArtemisiaannuaL.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素是从其地上部分分离出的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物,是目前世界上公认的最有效的治疗疟疾药物,特别是对脑型疟疾和抗氯喹疟疾更加有效。目前,世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(ACTs)。目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取,然而青蒿中青蒿素的含量非常低(0.01%~1%),使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。随着青蒿素生物合成途径的逐渐清晰,采用基因工程手段提高青蒿中青蒿素含量具有非常大的潜力,例如过量表达代谢途径中的青蒿素合成途径关键酶编码基因被证实是一种提高青蒿素含量的有效方法。在目前的青蒿基因工程研究中,多采用组成型的启动子,例如烟草花叶病毒35S启动子(CaMV35)。这种启动子能够驱动外源基因在所有的组织和器官中表达,可能会对植物的正常生长造成一定的负担和危害。由于腺毛不是植物生长所必须的,利用腺毛特异表达的启动子对植物的腺毛系统进行遗传操作不会对植物的生长发育造成危害。因此,克隆得到青蒿腺毛特异性的启动子对青蒿素代谢工程具有较为重要的意义。青蒿素合成途径中有许多关键的酶,包括AaADS,AaCYP71AV1,AaDBR2,AaALDH1等。其中AaADS和AaCYP的启动子已经被克隆出来了,但AaDBR2的启动子还没有报导。AaDBR2是从青蒿腺毛特异cDNA文库中分离出来的一个编码青蒿醛△11(13)双键还原酶的基因。先前的研究表明AaDBR2在青蒿腺毛中大量表达,而在其他组织中表达量很低,这暗示其启动子可能是腺毛特异表达的启动子。因此,克隆AaDBR2启动子对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。技术实现要素:本发明的目的在于克服现有技术中的不足,提供一种在植物分泌性腺毛中特异性表达的AaDBR2基因启动子DBR2pro1及其用途,本发明提供的启动子能引导基因在转基因植物的分泌性腺毛中特异表达。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:第一方面,本发明涉及一种AaDBR2基因启动子DBR2pro1,所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。第二方面,本发明还涉及前述AaDBR2基因启动子DBR2pro1在利用植物分泌性腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的用途。优选的,所述代谢产物为青蒿素。本发明涉及的AaDBR2基因启动子DBR2pro1的获得步骤具体如下:步骤一,培养青蒿无菌苗;步骤二,基因组DNA步移(GenomicDNAWalking)法克隆启动子基因组序列;步骤三,分析启动子上的顺式作用元件,确定AaDBR2基因启动子DBR2pro1的类型;步骤四,AaDBR2基因启动子DBR2pro1连入1391Z载体;步骤五,将构建好的载体1391Z-DBR2pro1载体转化根癌农杆菌;步骤六,将带有1391Z-DBR2pro1载体的根癌农杆菌转化青蒿;步骤七,PCR检测转基因植株;步骤八,启动子所引导的GUS报告基因在植株中的表达部位的确定。与现有技术相比,本发明具有如下的有益效果:本发明克隆得到的AaDBR2基因启动子DBR2pro1,可以特异性地在分泌性腺毛组织启动并高效表达外源基因,能广泛应用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述,本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:图1为1391Z-DBR2pro1与GUS基因融合的植物双元表达载体示意图;图2为转基因青蒿PCR阳性电泳检测结果;图3为非转基因青蒿在GUS染色下的幼嫩叶片的照片;图4为非转基因青蒿在GUS染色下幼嫩叶片的蓝光激发的荧光照片;图5为转DBR2pro1的阳性植株在GUS染色下的幼嫩叶片的照片;图6为转DBR2pro1的阳性植株在GUS染色下的幼嫩叶片的照片;图7为图5中转DBR2pro1的阳性植株在GUS染色下的幼嫩叶片的蓝光激发荧光照片;图8为图6中转DBR2pro1的阳性植株在GUS染色下的幼嫩叶片的蓝光激发荧光照片。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等分子克隆:实验室手册见NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress的1989年版中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。本实施例涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽,蒋细良,田云龙,郭萍,朱昌雄;根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究,中国生物工程杂志,2008,28(3):38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105可通过公开市售的商业渠道取得,如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得,菌株编号为Gambar1。下述实施例涉及一种AaDBR2基因启动子DBR2pro1的获得,具体包括如下步骤:步骤一,培养青蒿无菌苗青蒿种子用体积分数为75%的乙醇浸泡1min,再用20%(w/v)的NaClO浸泡20min后,无菌水冲洗3次~4次,用无菌吸水纸吸干表面水分,接种于无激素的MS固体培养基上,25℃、16h/8h(light/dark)光照培养,14天后即可获得青蒿无菌苗;步骤二,基因组DNA步移(GenomicDNAWalking)法克隆启动子基因组序列本实施例采用基因组DNA步移分离AaDBR2基因5′侧翼序列,基因组DNA步移的方法参照基因组WalkerTMUniversalKit(Clontech,638904)的说明书,具体步骤如下:(1)基因组酶切采用3种平末端的限制性内切酶DraI、EcoRV和StuI分别对青蒿基因组DNA进行酶切,反应体系如表1所示:表1限制性内切酶体系基因组DNA(0.1μg/μL)25μL限制性内切酶(10units/μL)8μL限制性内切酶buffer10μLddH2O57μL总体积100μL将反应体系轻轻地混匀,于37℃水浴中反应过夜;(2)接头三种酶切产物分别进行纯化,用20μL水溶解;取4μL酶切并纯化的DNA于新的EP管中,分别加入如下反应物:25μM的基因组WalkerAdaptor1.9μL,1.6μL10×LigationBuffer,6units/μL的T4DNA连接酶0.5μL,混匀后于16℃PCR仪中反应过夜;70℃水浴5min终止反应;加入72μL水后可用于PCR扩增;(3)PCR扩增为了提高产物的特异性,采用两轮巢式PCR扩增,基因组DNA步移中使用的引物如表2所示,其中AP1和AP2是试剂盒中附带的引物,DBR2-SP1和DBR2-SP2是根据AaDBR2基因的序列设计的特异引物,首轮PCR反应体系如表3所示,PCR反应条件为:94℃预变性3min;94℃25s,72℃3min,7个循环;94℃25s,67℃3min,32个循环;67℃延伸7min;表2基因组DNA步移引物引物名称引物序列(5′→3′)AP1GTAATACGACTCACTATAGGGCAP2ACTATAGGGCACGCGTGGTDBR2-SP1ATAAGAAAGCCACCAGCAGTTGADBR2-SP2ATTGAACTTGCCCATCTTGTAGG表3基因组DNA步移的反应体系首轮PCR的产物稀释50倍用作第二轮PCR的模版,第二轮PCR的反应体系如表4所示,PCR反应条件为:94℃预变性3min;94℃25s,72℃3min,5个循环94℃25s,67℃3min,20个循环;67℃延伸7min;PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测,回收得到的特异条带,连接到pMD18-T载体用于测序,将该片段的序列与AaDBR2基因的序列进行拼接,结果获得了AaDBR2基因上游约1.8kb的序列;表4基因组DNA步移的第二轮反应体系1:50稀释的第一轮PCR产物3μL10×exTaqBuffer5μLdNTP(2.5mMeach)3μLAP21μLDbr2-SP21μLexTaqDNA聚合酶0.5μLddH2O36.5μL步骤三,分析启动子上的顺式作用元件,确定AaDBR2基因启动子DBR2pro1的类型本实施例中得到启动子DBR2pro1是长度为1813bp的核苷酸序列,所述核苷酸序列如SEQIDNO.1所示,为了寻找启动子上的顺式作用元件,用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对AaDBR2基因的启动子DBR2pro1进行分析,发现在DBR2pro1上有TATAbox,ABRE,ACE,CAAT-box,CAT-box,HSE,LAMP-element,G-box,Wbox等,G-box发现于很多植物基因的启动子中,它是很多刺激响应启动子行使功能所必需的元件,它在植物启动子对光、无氧环境和植物激素的响应过程中起到重要的作用;另外,DBR2pro1的其它元件也可以对一些刺激做出响应,例如ABRE在ABA应答中起作用,Wbox在植物抗胁迫应答中起作用,以上的分析结果表明,DBR2pro1是诱导型的启动子,能受几种刺激物的诱导;步骤四,AaDBR2基因启动子DBR2pro1与GUS报告基因的融合并连入1391Z载体将AaDBR2基因的启动子DBR2pro1与GUS报告基因融合,研究该启动子驱动GUS基因在不同组织部位中的表达,为了方便表达载体的构建,正向引物中引入了PstI的酶切位点,反向引物中引入了BamHI的酶切位点,将DBR2pro1连入1391Z载体,载体的示意图如图1所示,引物如表5所示;表51391Z-DBR2pro1载体构建的PCR引物引物名称引物序列(5′→3′)1391Z-DBR2pro1-upgactgcagTGAAGGATGACCAAAAGCATAA1391Z-DBR2pro1-downgcggatccTATTGAATTTGATGTTGATCAGG步骤五,将构建好的载体1391Z-DBR2pro1载体转化根癌农杆菌将含DBR2pro1的片段和GUS基因融合的植物双元表达载体转入根癌农杆菌,并进行PCR验证,结果表明,含DBR2pro1片段的植物双元表达载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中,即获得含DBR2pro1和GUS基因融合的植物表达载体1391Z-DBR2pro1根癌农杆菌工程菌;步骤六,将带有1391Z-DBR2pro1载体的根癌农杆菌转化青蒿(1)外植体的预培养青蒿种子用体积分数为75%的乙醇浸泡1min;再用20%(w/v)的NaClO浸泡20min;无菌水冲洗3~4次;用无菌吸水纸吸干表面水分;接种于无激素的MS,该MS培养基采用Murashige和Skoog在1962年发明的固体培养基,该固体培养基可以通过商业渠道获得;25℃、16小时的日光和8小时的黑夜培养,即可获得青蒿无菌苗,待苗长至5cm左右后,剪取无菌苗叶片外植体用于转化;(2)农杆菌与外植体的共培养将所述的叶片外植体,转到1/2MS和100μmol/LAS组成的共培养培养基中,滴加活化好的含有所述DBR2pro1的植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液,使外植体与菌液充分接触,28℃暗培养3d,以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照;(3)抗性再生植株的筛选将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到MS、0.5mg/L6-BA、0.05mg/LNAA、50mg/LKan和500mg/LCb组成的发芽筛选培养基上,于25℃、16小时的日光和8小时的黑暗中培养,每两周继代培养一次,经过2~3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽,将生长良好的抗性丛生芽剪下转入1/2MS0和125mg/LCb组成的生根培养基上培养至生根,从而获得Kan抗性再生青蒿植株;步骤七,PCR检测转基因植株根据目的基因所在表达盒DBR2pro1-GUS序列中的DBR2pro1和GUS分别设计正向引物和反向引物(上游引物DBR2pro1:GACTGCAGTGAAGGATGACCAAAAGCATAA;下游引物GUS-down:GCCTGCCCAACCTTTCGGTATA)进行检测;利用所设计的PCR特异引物,进行两次独立的PCR检测,能扩增出特异DNA片段,而以非转化青蒿基因组DNA为模板时,没有扩增出任何片段,电泳结果如图2所示;步骤八,启动子所引导的GUS报告基因在植株中的表达部位的确定对PCR检测为阳性的青蒿植株,取其叶片进行GUS组织染色,图3所示为非转基因青蒿在GUS染色下的幼嫩叶片,图4为图3对应的蓝光激发的荧光照片;图5及图6所示为转DBR2pro1的阳性植株在GUS染色下的幼嫩叶片,图7和图8分别为图5和图6对应的蓝光激发荧光照片,结果表明,染色部位为青蒿的分泌性腺毛,说明DBR2pro1在转基因青蒿中能够引导外源基因在分泌性腺毛中特异表达。综上所述,本发明克隆得到的AaDBR2基因启动子DBR2pro1,可以特异性地在分泌性腺毛组织启动并高效表达外源基因,能广泛应用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是,本发明并不局限于上述特定实施方式,本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改,这并不影响本发明的实质内容。当前第1页1 2 3 
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