一种抗皮肤癣菌的特异性卵黄抗体及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物制药技术，特别涉及一种抗皮肤癣菌的特异性卵黄抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

真菌广泛的存在于世界各地，主要存在于土壤里及人和动物上。其中，常见的由真菌感染的疾病为皮肤癣。例如：脚气，牛皮癣等。皮肤癣菌在增殖过程中深入到真皮层，刺激真皮层的神经系统引发瘙痒的症状；局部组织液聚集，皮肤组织破损后极易继发细菌感染，导致炎症反应，这类由于感染皮肤癣菌而引发的一系列皮肤组织病理现象称为皮肤癣菌病。皮肤癣菌病是人类的常见病，至少有10-20％的世界人口可能感染这些病原体。近年来，由于抗生素和免疫抑制剂的广泛应用，以及免疫缺陷病发病率上升等因素，使皮肤癣菌病的发病呈逐渐上升趋势，加之人们保健意识的提高，因此皮肤癣菌病日益受到重视。

皮肤癣菌病包括体癣、手足癣、股癣、面癣等。常见的皮肤癣菌分为三种、分别是毛癣菌属、小孢子菌属和表皮癣菌属。其中红色毛癣菌和须癣毛癣菌为最常见两种致病菌株，可以感染人体的头部、躯干部、四肢，也是人类感染的最主要皮肤癣菌类型。这两种菌均属于毛癣菌属，真菌结构相似，故通过两种菌得到的血清抗体有交叉性，特异性不强。此外，特异性抗体的被动免疫是预防和治疗传染性疾病有效方法之一。免疫治疗往往需要大量的特异性抗体。研制安全、高效价和廉价的抗体己是当前研究的热点。

1893年Klemperer发现存在于产卵母鸡血清中的抗体转移到卵黄中，在胚胎发育早期作为主要的免疫球蛋白为雏鸡提供被动的免疫保护。因该抗体相似于哺乳动物IgG分子而又存在于卵黄中，故称其为卵黄抗体(IgY)。由于从卵黄中分离纯化IgY比较困难，此后在很长的时间里，人们只对鸡的免疫系统和IgY的结构性质进行了相关研究。直到1980年，Poison等提出了PEG沉淀法，使得从卵黄中分离IgY变得简单易行，自此国内外学者对IgY的应用进行广泛的研究。IgY具有许多显著的优点：①不需要杀生或者采血，只需收集免疫母鸡产下的蛋经提取可得，符合现代动物保护法；②使用少量的抗原免疫禽类即可获得大量的质量均一的特异性IgY，成本低，产量高；③由于种系发生距离相差很大,IgY不会与IgG发生交叉血清学反应；④IgY的性质更稳定，便于保存和应用；⑤与IgG相比，IgY非常重要的一个性能特点在于，不仅具有与抗原结合的能力，而且对其抗原菌的生长具有显著的抑制作用。鉴于其拥有独特的免疫化学性质，且适于生产特异性抗体，IgY在免疫治疗和免疫诊断领域均有广泛应用前景，其被动免疫功能可以用于抗病毒和细菌性疾病，具有开发功能性食品和新药的潜能。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种抗皮肤癣菌的特异性卵黄抗体的制备方法。

本发明的再一目的在于提供一种由上述制备方法制备得到的抗皮肤癣菌的特异性卵黄抗体。

本发明的又一目的在于提供一种利用上述抗皮肤癣菌的特异性卵黄抗体的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种抗皮肤癣菌的特异性卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)选取红色毛癣菌或须癣毛癣菌，先固体培养一周后采用液体培养；

(2)液体培养后进行冲洗和离心，得到的菌丝经过液氮研磨，超声破碎，离心得到细胞壁；利用冷碱抽提法提取真菌的细胞浆蛋白，离心得到上清液；将上清液透析后获得皮肤癣菌细胞壁蛋白抗原；

(3)选取20周龄产蛋母鸡；将皮肤癣菌细胞壁蛋白抗原用PBS缓冲液稀释成1mg/ml的皮肤癣菌细胞壁蛋白抗原溶液；将皮肤癣菌细胞壁蛋白抗原溶液与弗氏完全佐剂按照体积比1:1混合乳化，采用皮下多点注射的免疫方式对每只母鸡注射0.5ml；首次免疫两周后进行第一次加强免疫，用等体积的弗氏不完全佐剂与皮肤癣菌细胞壁蛋白抗原溶液混合乳化，采用皮下多点注射的免疫方式对每只母鸡注射0.5ml，以后每隔15天进行加强免疫一次，一共加强免疫4次，从第一次加强免疫开始收集免疫鸡蛋，并存放于4℃；

(4)将获得的免疫鸡蛋用酒精消毒，破壳收集蛋黄，与冻存蒸馏水按照体积比为1:9混匀，离心获得水溶性成分，采用PEG6000进行沉淀获得卵黄抗体干粉，于-20℃保存。

步骤(1)所述固体培养是采用SDA固体培养基；所述液体培养基是采用SDA液体培养基。

步骤(2)所述液氮研磨的过程中加入10mM EDTA，10mM PMSF抑制蛋白酶。

步骤(3)采用PEG6000沉淀法提取IgY，以及饱和硫酸铵溶液纯化IgY，纯化效果较好，得到的IgY也较为纯净。

一种根据上述的制备方法制备得到的抗皮肤癣菌的特异性卵黄抗体。

上述的抗皮肤癣菌的特异性卵黄抗体在制备预防和治疗皮肤癣疾病的软膏、喷剂、洗手液或湿纸巾中的应用，无毒副作用，安全可靠。所述皮肤癣疾病包括手癣、趾癣、体癣等。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：本发明利用皮肤癣致病菌的两种细胞壁蛋白，制备出抗皮肤癣菌的卵黄抗体具有较强特异性，能够有效的抑制皮肤癣菌，无毒副作用；本发明所述的方法易于大规模生产，成本低廉，工艺简单，得到的是产品是一种非常安全的抗皮肤癣疾病的制剂。

附图说明

图1为红色毛癣菌细胞壁蛋白的IgY效价消长规律。

图2为须癣毛癣菌细胞壁蛋白的IgY效价消长规律。

图3为IgY的SDS-PAGE电泳图，其中1为红色毛癣菌细胞壁蛋白的IgY粗品；2为红色毛癣菌细胞壁蛋白的IgY纯品；3为须癣毛癣菌细胞壁蛋白的IgY粗品；4为须癣毛癣菌细胞壁蛋白的IgY纯品。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：皮肤癣菌蛋白抗原的制备

(1)通过SDA固体培养基培养红色毛癣菌和须癣毛癣菌，然后接种于液体培养基中大量培养，离心，用PBS冲洗，得到大量菌丝；

(2)细胞壁蛋白的提取：对于(1)培养的菌丝，采用液氮研磨，加PBS溶解，加入10mM EDTA，10mM PMSF抑制蛋白酶；采用超声细胞粉碎机及匀浆机破壁，菌丝细胞质释放，离心分离得到细胞壁；加入4℃，0.1N NaOH于细胞壁沉淀中，在4℃下搅拌24h，4℃，12000g，10min离心后得到滤液，用预冷的1mol/l的HCl中和滤液；将滤液用50mM Tris-Hcl透析三天，即为皮肤癣菌细胞壁蛋白抗原。将皮肤癣菌细胞壁蛋白抗原用PBS缓冲液稀释成1mg/ml的皮肤癣菌细胞壁蛋白抗原溶液，备用。

实施例2：抗皮肤癣菌卵黄抗体的制备

(1)用抗皮肤癣抗原免疫产蛋母鸡

选取20周龄产蛋母鸡12只；将实施例1所得皮肤癣菌细胞壁蛋白抗原溶液与弗氏完全佐剂按照体积比1:1混合乳化，采用皮下多点注射的免疫方式对每只母鸡注射0.5ml；首次免疫两周后进行第一次加强免疫，用等体积的弗氏不完全佐剂与皮肤癣菌细胞壁蛋白抗原溶液混合乳化，采用皮下多点注射的免疫方式对每只母鸡注射0.5ml，以后每隔15天进行加强免疫一次，一共加强免疫4次，从第一次加强免疫开始收集免疫鸡蛋，连续收集三个月的免疫鸡蛋，按照天数进行编号，并存放于4℃；

(2)抗抗皮肤癣特异性卵黄抗体的提纯

将获得的免疫鸡蛋用酒精进行消毒，鸡蛋破壳去膜收集蛋黄，测定蛋黄体积，加入蛋黄3倍体积的3.5％的PEG6000的PBS溶液混匀，调节PH为7.2，搅拌40min后，4℃保存过夜；4℃，10000g离心20min后取上清液，用四层纱布过滤，得到的滤液，测定滤液体积；滤液中加入PEG6000粉末使最终浓度为12％，调PH至7.2，充分混匀，搅拌30min；4℃，10000g离心20min，弃上清得沉淀，即为IgY粗品。

沉淀用4℃1mol/l PBS缓冲液(PH＝7.2)溶解后，4℃，10000g离心10min，取上层，滴入与滤液等体积的饱和硫酸铵溶液，然后4℃静置过夜；4℃，10000g离心10min，得到沉淀，用PBS缓冲液(PH＝7.2)溶解，再加入1/2体积的饱和硫酸铵溶液，4℃静置2h；4℃，10000g离心20min，得到沉淀物；在-60℃下真空冷冻干燥12h，制成了抗皮肤癣特异性卵黄抗体的干粉纯品，于-20℃保存。

实施例3：抗皮肤癣特异性卵黄抗体的效价检测

采用ELISA检测各类抗原免疫得到的卵黄抗体的效价。采用96孔酶标板，每孔加100μl的包被红色毛癣菌和须癣毛癣菌的全菌抗原于两块酶标板上，用封膜覆盖，37℃温育2h，然后甩干，用PBST洗涤3次，吸水纸拍干；加入100μl/孔30mg/ml脱脂奶粉进行封闭，37℃温育1h，然后甩干，用PBST洗涤3次，用吸水纸拍干；分别取红色毛癣菌和须癣毛癣菌的两种细胞壁蛋白免疫所得的IgY倍比稀释，100μl/孔加入酶标板中，最后一行加入未免疫作为空白对照，37℃温育1h，然后甩干，用PBST洗涤3次，用吸水纸拍干；每孔再加入1:5000的兔抗鸡IgY-HRP抗体100μl，37℃温育1h，然后甩干，用PBST洗涤3次，用吸水纸拍干；每孔加入100μl的TMB底物液，37℃温育15min，然后每孔加入50μl的2mol/l的H₂SO₄终止反应。用酶标仪测490nm波长的OD值。结果如图1、图2和表1所示。

表1抗皮肤癣特异性卵黄抗体的效价检测结果

实施例4：采用SDS-PAGE测定抗皮肤癣特异性卵黄抗体的纯度

用SDS-PAGE电泳检测得到的抗皮肤癣卵黄抗体的纯度，如图3。具体如下：使用12％分离胶，5％浓缩胶，以marker为对照品，电泳结束后用考马斯亮兰染色，最后脱色。结果表明：纯度可达到90％以上。

实施例5：体外抑菌试验

(1)菌悬液的制备：取红色毛癣菌、须癣毛癣菌菌株，用PBS缓冲液冲洗、稀释，使菌悬液混匀，用血平板计数法，选取浓度在3×10⁴的菌悬液。

(2)抑菌实验：取适量制备的IgY冻干粉溶于灭菌好的SDA液体培养基中，使初始浓度为80mg/ml，用培养基稀释成：40,20,10,5,2.5,1.25mg/ml，各取2ml于7只小试管中，取2mlSDA液体培养基于第八只试管作为空白对照。再分别加入2ml的菌悬液。放置28℃，160r/min的摇床中培养一周。取出后，可观察出，空白对照已长出大量菌丝球，其他试管对真菌均有不同程度的抑制作用。稀释后的抗体浓度为20mg/ml的试管为最低抑菌浓度。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。