一株表达绿色荧光蛋白（EGFP）基因的人肠道病毒EV71型重组病毒及其应用的制作方法

本发明涉及一株表达绿色荧光蛋白(EGFP)基因的人肠道病毒EV71型重组病毒及其应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术：

肠道病毒属于小RNA病毒科(Picornaviridae)，分为肠道病毒A(human enterovirus A,HEV-A)、B(HEV-B)、C(HEV-C)、D(HEV-D)等4种类型。肠道病毒71型(enterovirus type 71,EV71)属于HEV-A。EV71自1969年首次被报道以来，已经引发全球范围内的10多次爆发与流行。EV71感染主要引起患者手足口病，还能引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹等多种与神经系统相关的疾病。

EV71的基因组为约7.4kb的单股正链RNA，仅含一个开放阅读框(open reading frame,ORF)，编码含有2193个氨基酸的多聚蛋白(poly-protein)。在基因组的5'端和3'端分别有约为745nt的5'非编码区(untranslated region,UTR)和约为83nt的3'非编码区。

目前，人类是该病毒唯一已知的自然宿主，主要通过粪口传播，还可通过飞沫传播，且10岁以下儿童为主要易感人群，其他则以隐性感染为主。根据VP1的序列差异，主要将EV71分为A、B、C 3个基因型。B和C型各包括5个亚型，分别为B1-B5和C1-C5。目前，尚无有效的疫苗能够预防EV71的感染，临床上也缺乏特异高效的抗病毒药物，只能以对症支持治疗为主。

病毒的结构蛋白或者其他蛋白经荧光蛋白标记后，组装成的重组病毒将带上荧光标记或者在侵染细胞中释放荧光标记，从而能够被示踪。这种荧光标记技术让我们可以在活细胞中显示并研究病毒，近年来，GFP己经成功地用于标记艾滋病病毒、腺相关病毒以及疱疹病毒等多种病毒。

同样国内的研究也日益增多，华中科技大学同济医学院成功地将TC标签(C-C-P-G-C-C)在基因水平上插入到乙型肝炎病毒HBV核心蛋白免疫主区c/el位点，获得了动态观察HBV荧光体在活细胞中生物学行为的基因重组乙型肝炎示踪病毒。江军等人则制备了家蚕浓核病毒结构蛋白VP4与EGFP融合表达的荧光病毒样颗粒，为家蚕病毒的防治奠定了基础。山东大学彭莹等构建了表达绿色荧光蛋白的巨细胞病毒Towne株，并检测了其功效，该荧光病毒可以作为研究巨细胞病毒致病机制和抗病毒药物筛选的新型工具。

可见利用各种荧光蛋白或者其他物质对病毒结构蛋白进行标记或者伴随病毒结构蛋白同时表达，即可完成对病毒侵染细胞过程和繁殖状况的观察，也可为抗病毒药物筛选和作用机制研究提供帮助。

朱守海等将EGFP基因连入EV71病毒基因组5’端，实现了EGFP与病毒蛋白的融合表达，最后再利用2A酶活性去除GFP，使EV71病毒子代颗粒顺利组装。然而该设计中添加的EGFP基因在表达成GFP蛋白后，与病毒蛋白呈融合状态，可能会影响病毒蛋白的成熟及组装效率，进而影响病毒的繁殖。

技术实现要素：

本发明的目的在于一株表达绿色荧光蛋白(EGFP)基因的人肠道病毒EV71型重组病毒及其应用，本发明利用反向遗传学技术拯救出表达绿色荧光蛋白EGFP基因人肠道EV71型重组病毒，该病毒经传代检验证实具有遗传稳定性，并具有与野生病毒株相当的病毒毒力。

本发明在EV71型病毒基因组的3D蛋白编码区后面添加B型肝炎病毒的link序列，link序列连接EGFP基因，从而构成荧光蛋白标记的病毒基因组。具体为：在EV71型病毒基因组的第7218位碱基后插入link序列，link序列之后插入自带终止密码子TTA的EGFP基因，EGFP序列之后连入EV71型病毒3’端非翻译区，即第7218位以后序列。该结构不影响病毒翻译后的蛋白加工修饰，产生的GFP蛋白也不影响子代病毒颗粒组装。转染RD细胞拯救出表达EGFP基因的重组病毒：EV71-Link-GFP。

本发明将EGFP基因整合进EV71型病毒基因组3’端，前面与病毒基因编码区通过link序列相连，link序列来自于B型肝炎病毒，该设计特点是：能够实现GFP蛋白与病毒蛋白的共表达，但不是融合蛋白，因此不影响子代病毒颗粒的组装，且即使病毒基因组5’端缺陷时，也不影响EGFP基因表达，完好实现对病毒侵入细胞进行示踪。该重组病毒基因组质粒感染RD细胞后，在繁殖的同时，表达释放绿色荧光蛋白，并拯救获取荧光病毒。

本发明的有益效果：

本发明重组病毒能够高效表达EGFP基因，病毒生长曲线与野生病毒株相似，插入的EGFP基因在连续传代过程中较为稳定。该荧光标记病毒株可用于借助酶标仪建立中草药或中草药单体抗病毒的高通量筛选技术(平台)，也可用于EV71型病毒侵染细胞的机理机制研究。

附图说明

图1为pEGFP-N1-EV71-link-EGFP质粒的构建示意图；

图2A为重组病毒EV71-link-EGFP与亲本病毒EV71-WT免疫荧光，检测第一代及第三代免疫荧光；

图2B为PCR鉴定结果；

图3为重组病毒EV71-link-EGFP与亲本病毒EV71-WT的生长曲线，可见EV71-link-EGFP与亲本病毒生长动力学较为相似；

图4为重组病毒EGFP基因表达的动力学，可见EV71-link-EGFP表达绿色荧光蛋白的峰值出现在48h；

图5为Western blot检测重组病毒EV71-link-EGFP和EV71-WT病毒的P1蛋白和GFP蛋白的表达；

图6为IFA测定重组病毒在连续传代过程中的病毒滴度，可见重组病毒滴度在传代过程中略有升高并最终趋于稳定；

图7为测定重组病毒在连续传代过程中表达的GFP蛋白，可见在传代过程中，EV71-link-EGFP的EGFP基因表达活性基本没变。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2005)等本领域常用工具书中所述的条件，或按试剂生产厂家所建议的条件进行。

实施例1：携带EGFP基因的EV71-link-EGFP重组病毒的拯救

1.1携带EGFP基因的全长感染性克隆的构建

根据亲本病毒EV71型(GenBank:JF738002.1)全长序列分析，选择在病毒基因组的第7218位(1-7218位见SEQ ID NO.1)碱基后插入link序列(见SEQ ID NO.2)，link序列之后插入EGFP基因(自带终止密码子TTA，见SEQ ID NO.3)，最后连入EV71型病毒3’端非翻译区，即第7218位以后序列(见SEQ ID NO.4)。在全基因组序列的5’端添加Sac I酶切位点，3’端添加Not I酶切位点。

根据选定的外源基因插入位点和酶切位点，分别设计引物通过PCR的方法获得各个片段，相邻片段间有20bp的相同碱基，将PCR产物与用SacI和Not I线性化的pEGFP-N1载体等比例混合，用EZfusion同源重组酶(上海捷瑞生物有限公司)处理后转化大肠杆菌，即获得重组EV71型病毒基因组。具体构建策略见图1。

1.2重组病毒的拯救

用大提试剂盒提取pEGFP-N1-EV71-link-EGFP质粒，按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书将大提的质粒转染至生长为70％的RD细胞培养板中(6孔板)，转染剂量为2.5μg，6h后换为含有质量分数为3％胎牛血清的DMEM维持液，并将转染的六孔板置于37℃、5％CO₂(CO₂均为体积分数)孵箱中培养72h，使质粒能够在细胞内更有效的转录病毒基因组RNA。72h后换为2％的DMEM维持液，并将细胞转移到33℃、5％的CO₂孵箱中培养72h。为了获得更多的病毒，在33℃、5％CO₂培养3天后的细胞，以1∶3的比例传代到细胞培养瓶中，37℃、5％CO₂培养48h。待细胞融合达到80％左右时，换为2％的DMEM维持液，转入33℃、5％CO₂孵箱中进行培养，3天后收取细胞和上清，经37℃与-80℃反复冻融3次，混合后于3000r/min离心5min，0.45μm的滤膜过滤，将收获的病毒并分别命名为EV71-link-EGFP。

实施例2：EV71-link-EGFP重组病毒的鉴定

2.1间接免疫荧光试验(IFA)鉴定重组病毒

将实施例1拯救的重组病毒EV71-link-EGFP及其亲本病毒接种于生长至70％的RD细胞中，2h后用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗1遍并换为新鲜的含质量分数为4％胎牛血清的DMEM，在5％CO₂、37℃环境中继续培养，72h后用抗P1蛋白血清进行IFA试验。

具体操作如下：弃掉培养液，用PBS清洗细胞2遍，然后用冷无水乙醇固定细胞，30min后加入抗P1蛋白的血清，在室温下作用2h后用PBS洗涤细胞3次，并加入1∶200稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG，于室温中避光作用1h，用PBS洗涤细胞3次，5min/次，在倒置荧光显微镜下观察并拍照。

提取细胞总RNA，利用TaKaRa反转录试剂盒获得cDNA，以cDNA为模板，用引物EV71F(5’-GCAATTAGATCCGTCCCAATAGG-3’)和linkR(5’-TTACCCTCGGATCCAACAAGG3’)鉴定link序列的链接，结果正确；用引物EV71F与GFPR(5’-TGGCATCGCCCTCGCCCTCG-3’)鉴定GFP基因的链接，结果证实EGFP基因链接位置正常。

如图2所示间接免疫荧光试验证实，重组病毒拯救成功。

2.2 EV71-link-EGFP重组病毒生长曲线的测定

将实施例1拯救的重组病毒和亲本病毒分别按每孔MOI＝0.01的感染量接种于生长至单层的RD细胞中，并在感染后24h、48h、72h、96h、120h、144h和168h收获病毒。将不同时间点收获的病毒分别用IFA测定病毒滴度，并绘制出病毒的生长曲线。

比较重组病毒与亲本病毒的生长动力学，结果显示，EV71-link-EGFP病毒滴度的峰值与亲本病毒滴度的峰值相同，如图3所示。

2.3 EV71-link-EGFP重组病毒报告基因表达动力学测定

为了确定实施例1拯救的重组病毒表达EGFP基因的能力，将重组病毒按MOI＝0.01剂量感染24孔板中RD细胞，并在感染后24h、48h、72h、96h、120h、144h和168h测定EGFP转录表达，如图4所示，表明在重组病毒中，EGFP的表达(荧光强度)在48h最高。

2.4 EV71-link-EGFP重组病毒western blot

为了进一步验证重组病毒表达EGFP基因的能力，将感染实施例1拯救的重组病毒及其亲本病毒的RD细胞在72h后裂解并用Western blot检测GFP蛋白和P1蛋白的表达情况，以亲本病毒作为对照。

Western blot检测结果显示GFP蛋白表达正常且稳定，如图5所示。

2.5重组病毒遗传稳定性分析

将实施例1拯救的EV71-link-EGFP重组病毒在RD细胞上进行13次传代，以检查插入的EGFP基因在四株重组病毒基因组中的遗传稳定性。将上述EV71-link-EGFP重组病毒(定义为P0)以MOI＝0.01剂量感染RD细胞。在感染96h，收获病毒，并定义为N1，之后将300μl N1代病毒液加入到新鲜RD细胞中培养(定义为N2)。经过13轮类似的传代，测定病毒滴度如图6所示，结果显示滴度变化不大；第13代感染细胞后，收获细胞，用western blot检测P1和GFP蛋白，并以野生型为对照(WT)。结果表明，重组病毒在RD细胞上连续传代的过程中第13代病毒表达的GFP蛋白与第1代无明显差别，并未发生病毒传代丢失EGFP基因等现象，如图7所示。

以上结果表明，重组病毒EV71-Link-EGFP具有稳定的遗传性，并能高效表达绿色荧光蛋白，可根据荧光强度用于指示病毒侵入细胞的数量。其具体操作如下：

于96孔板培养细胞至60-90％融合度，每空分别加入病毒与不同量中草药成分，病毒侵染48小时候，用去掉培养基，用PBS清洗一次细胞，然后加入100μlPBS，置于酶标仪中，设置激发波长为485nm，发射波长为535nm，从板的上部往下读数检测细胞荧光强度，即可评估药物对病毒侵染细胞的干预程度，所以将来可以借助酶标仪等相关仪器构建抗病毒中草药的高通量筛选平台。