用于生产2‑羟基吩嗪的基因工程菌株及其制备方法和用途与流程

本发明涉及一种用于生产2-羟基吩嗪的基因工程菌株及其制备方法和用途，属于基因工程技术领域。

背景技术：

吩嗪衍生物是一类含氮杂环化合物，一般都有一定颜色，具有特定的吸收波谱，这是由于杂环上存在不同的取代基所致，这决定了它们不同的理化性质及抑制植物和动物病原菌的生物活性。几乎所有的吩嗪化合物对细菌和真菌都有生物防治活性。吩嗪化合物具有一定的氧化还原活性，在细胞中可能作为电子载体，当细胞进行氧化还原反应时，将电子传递到靶细胞，导致靶细胞中超氧化物的氧自由基增加而使细胞死亡。

天然吩嗪化合物具有广谱的抗菌活性，目前已经发现了近100种具有相似结构的天然吩嗪类化合物，不仅对小麦全蚀病、水稻枯萎病等病原菌有显著的抑制作用，还可用于肺结核、白血病、结核杆菌和非典型耐酸杆菌及麻风病等疾病的治疗，已经在医药、农业领域越来越引起人们的重视。天然吩嗪化合物主要由细菌或放线菌产生合成，主要包括吩嗪-1-羧酸(PCA)、1-羟基吩嗪(1-hydroxyphenazine)、2-羟基吩嗪(2-hydroxyphenazine)，绿脓菌素(pyocyanin)和吩嗪-1-羧酰胺(phenazine-1-carboxamide)等。Kiprianova等人曾对PCA、2-羟基吩嗪-1-羧酸和2-羟基吩嗪的抗菌性进行过研究比较，发现在对细菌、真菌和动植物病菌的拮抗作用中，2-羟基吩嗪的抗菌性是最强的[Smirnov V V,Kiprianova E A.Bacteria of Psedunomonas genus.Naukova Dumka,Kiev,Ukraine,1990:100-111.]。Thomashow L.S.等人也做过相关研究，发现同时合成吩嗪-1-羧酸和2-羟基吩嗪的菌株比只产吩嗪-1-羧酸菌株的抗菌活性要强很多[Delaney S M,Mavrodi D V,Bonsall R F,et al.phzO,a gene for biosynthesis of2-hydroxylated phenazine compounds in Psedunomonas aureofaciens 30-84.Journal of Bacteriology,2001,183(1):318-327.]。本课题组张雪洪的专利CN200610117059.4中，绿针假单胞菌GP72的主要活性物质即为吩嗪-1-羧酸、2-羟基吩嗪-1-羧酸和2-羟基吩嗪，其活菌制剂可用于对辣椒、黄瓜、冬瓜、南瓜、番茄、茄子、韭菜、大蒜、菜豆、豇豆的疫病防治；用于对油菜菌核病、黄瓜枯萎病、西瓜枯萎病、西瓜炭疽病、棉花立枯病、水稻纹枯病的防治；还可以作为蔬菜生长促进剂使用，提高蔬菜产量。由此可见，2-羟基吩嗪存在巨大的抗生潜力，因此大规模制备2-羟基吩嗪具有重大的意义

在人工培养条件下，部分微生物可以大量合成较高浓度的吩嗪化合物，比如绿针假单胞菌HT66能够高水平合成吩嗪-1-甲酰胺(彭华松等，ZL 2013 1 0566864.5)。然而，研究发现目前能分泌2-羟基吩嗪的绿针假单胞菌菌株，其合成效率都不高，无法实现大规模生产，对研究2-羟基吩嗪的抑菌作用、代谢调控及其工业化应用等都造成了障碍。

技术实现要素：

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种用于生产2-羟基吩嗪的基因工程菌株及其制备方法和用途。

本发明是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供了一种用于生产2-羟基吩嗪的基因工程菌株，其特征在于，可通过如下方法获得：

将绿针假单胞菌HT66(Psedunomonas chlororaphis HT66)CCTCCNO:M2013467及其衍生物基因组中的phzH基因(phzH的基因的碱基序列和对应蛋白质的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)替换为外源的phzO基因，即得。

作为优选方案，所述phzO基因来自绿针假单胞菌株GP72(参见Liu H,He Y,Jiang H,et al.Characterization of a phenazine-producing strain Psedunomonas chlororaphis GP72 with broad-spectrum antifungal activity from green pepper rhizosphere[J].Current microbiology,2007,54(4):302-306.)、菌株30-84(参见Pierson L S,Keppenne V D,Wood D W.Phenazine antibiotic biosynthesis in Psedunomonas aureofaciens 30-84is regulated by PhzR in response to cell density[J].Journal of Bacteriology,1994,176(13):3966-3974.)、菌株Pa40(参见Jiao Z,Wu N,Hale L,et al.Characterisation of Psedunomonas chlororaphis subsp.aurantiaca strain Pa40with the ability to control wheat sharp eyespot disease[J].Annals of applied biology,2013,163(3):444-453.)或菌株O6(参见Cho S M,Kang B R,Han S H,et al.2R,3R-butanediol,a bacterial volatile produced by Psedunomonas chlororaphis O6,is involved in induction of systemic tolerance to drought in Arabidopsis thaliana[J].Molecular plant-microbe interactions,2008,21(8):1067-1075.)。

来源于绿针假单胞菌株GP72、30-84、Pa40、O6的phzO基因的碱基序列分别如SEQ ID NO3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。

第二方面，本发明提供了一种如前述的用于生产2-羟基吩嗪的基因工程菌株的制备方法，其包括如下步骤：

1)重组质粒的构建；

2)双亲杂交；

3)基因替换突变株的筛选。

作为优选方案，所述重组质粒的构建包括如下操作：

分别设计用于扩增phzH的上游同源臂引物F1和R1、下游同源臂引物F3和R3，以及phzO及其启动子区域总片段的正反向引物F2和R2，并扩增相关片段；

通过Infusion体系连接质粒pK18mobsacB，将phzO基因与phzH基因的上游片段和下游片段整合在一起；

重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；

其中，所述F1、R1、F2、R2、F3和R3的基因序列分别如SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12所示。

作为优选方案，所述Infusion体系的用量为10μL，且Infusion体系中，pK18mobsacB质粒3uL、infusion酶2μL、水2μL、phzO基因1μL、phzH上游同源臂1μL和phzH下游同源臂1μL。

作为优选方案，所述双亲杂交包括如下操作：

将测序验证正确的质粒转化大肠杆菌S17感受态细胞并测序验证；

将绿针假单胞菌株HT66活化后，接种于液体KB培养基中，在28℃下培养12h；将携带质粒的大肠杆菌S17接种于含50mg/L的Kan的LB培养基中，置37℃下180rpm的摇床中培养12h；

分别将绿针假单胞菌HT66和大肠杆菌S17菌液离心，以LB培养基分别重悬菌体，将二者以1:1的比例混合，并置于28℃培养箱中1h，使其发生接合转移。

作为优选方案，所述基因替换突变株的筛选依次采用单交换阳性克隆的筛选和双交换阳性克隆筛选。

作为优选方案，所述单交换阳性克隆筛选包括如下操作：

将菌株HT66与S17的混合菌液离心，弃去部分上清液，将菌体重悬后稀释涂布于含浓度分别为100mg/L的Amp和50mg/L的Kan的LB平板上，置于28℃培养箱中培养48h，挑取菌落以PCR扩增融合片段进行验证。

作为优选方案，所述双交换阳性克隆筛选包括如下操作：

挑取单交换克隆以LB培养基重悬，并稀释涂布于含有15％(w/v)蔗糖的LB平板上，置于28℃培养箱中培养24h；将生长的菌落分别接种于LB平板和含50mg/L的Kan的LB平板中，接种位置一一对应，置于28℃培养箱中培养24h；选择在Kan平板上不能长而在LB平板生长的菌落，使用外部引物F1和R3进行PCR验证。

第三方面，本发明还提供了一种如前述的基因工程菌株在制备2-羟基吩嗪中的用途。

所述基因工程菌株在制备2-羟基吩嗪时的条件为：好氧培养；温度：28～32℃；pH：6～8；转速150～300rpm。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明基于一株高产吩嗪-1-甲酰胺的绿针假单胞菌HT66，该菌属于植物根际细菌，安全可靠，营养需求简单，副产物，发酵周期短，经改造后其吩嗪化合物的产量达到3500mg/L的水平，具有良好的工业化应用潜力。本专利将其中的phzH基因替换为外源的phzO基因，高浓度的吩嗪-1-羧酸不再转为吩嗪-1-甲酰胺，而是作为底物在PhzO蛋白在作用下转化为高水平的2-羟基吩嗪。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为phzO基因与phzH上下游同源臂的扩增产物电泳图：a、phzO基因的扩增片段(L2)和phzH基因的上下游同源臂(分别为L1和L3)；b、以外部引物F1和R3对重组质粒进行PCR验证；c、以内部引物F2和R2对此质粒进行PCR验证；

图2为突变株中phzO基因的PCR产物电泳图；

图3为不同绿针假单胞菌株发酵液的HPLC图谱：A、HT66菌株；B、GP72菌株；C、HT66-S菌株；

图4为菌株HT66-O与HT66生长曲线对比图；

图5为菌株HT66-O中吩嗪-1-羧酸的发酵曲线；

图6为菌株HT66-O中2-羟基吩嗪的发酵曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明的绿针假单胞菌(Psedunomonas choloraphis)HT66，该菌株已在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏单位地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编为：430072，保藏日期为：2013年10月12日，保藏编号为：CCTCC NO∶M 2013467。

实施例1

本实施例涉及一种用于生产2-羟基吩嗪的基因工程菌株的制备方法，包括如下步骤：

根据绿针假单胞菌GP72基因组中phzO序列设计引物F2(5'GGTACCGAGATAAACATGCTTTGAAGTGC 3'，如SEQ ID NO.9)和R2(5'CTATTTGGCGTTGAGCCCCACCATA 3'，如SEQ ID NO.10)，通过PCR扩增phzO基因并纯化；

根据绿针假单胞菌HT66基因组中phzH基因的上下游序列设计引物。上游引物为F1(5'ACATGATTACGAATTAGCCGCTGTTGGGTAAAGG 3'，如SEQ ID NO.7)和R1(5'GTTTATCTCGGTACCTCAGGGTTGCAAACGCC3'，如SEQ ID NO.8)，下游引物为F3(5'CTCAACGCCAAATAGTACGAGCCTGAGGGAGCCACGGCAG 3'，如SEQ ID NO.11)和R3(5'CGACTCTAGAGGATCATGGCCGAACCACCCTTGC 3'，如SEQ ID NO.12)，以该基因组DNA为模板，扩增基因组中的相应片段，其电泳验证结果见图1a。

通过Infusion体系将phzO基因与phzH基因的上游片段和下游片段整合在一起并连接质粒pK18mobsacB(Infusion体系10uL，其中pK18mobsacB质粒3uL，infusion酶2uL，水2uL，目的基因及phzH上下游同源臂各1uL)，获得体外突变质粒并转化大肠杆菌S17。提取质粒后分别以外部引物F1和R3对重组质粒进行PCR验证(结果见1b)，以内部引物F2和R2对此质粒进行PCR验证(结果见图1c)，由此可见phzO基因(长度为1.8kb)成功替换phzH基因。

将携带重组质粒的S17菌株充分活化，接种于含有卡那霉素50mg/L的LB培养基中，37℃，180rpm培养12h。将充分活化的HT66菌株接种于LB培养基中，28℃，180rpm 培养12h。5000rpm离心后收集并洗涤两种菌体，以LB培养基重悬。将菌株GP72：S17浓度以1:1的比例混合，置于28℃培养箱中1h，使其发生接合转移。

取混合菌液点在LB平板中，28℃培养24h，刮取长出来的混合菌落于LB中重悬，稀释涂布于卡那霉素50mg/L，氨苄霉素100mg/L的LB平板上，28℃培养2至3天后挑取单克隆涂布于含15％(w/v)蔗糖的LB平板中，28℃培养1至2天；挑取蔗糖平板上的单克隆，PCR验证；挑取在卡那霉素50mg/L抗性平板上不生长，但在无抗平板上能够正常生长的单菌落，即为同源重组成功的菌落。将该菌株命名为HT66-O。

以引物F2和R2对筛选的突变株进行PCR验证(见图2)，PCR扩增片段长度为1.8kb，与phzO基因大小一致，表明该基因已成功插入菌株HT66的基因组中。

实施例2

本实施例涉及不同绿针假单胞菌合成吩嗪化合物的比较，具体步骤为：

将三种绿针假单胞菌GP72、HT66和HT66-O的发酵液各取1.5mL到5mL离心管，首先用6N HCl调节pH值至2.0，接着用等体积的乙酸乙酯振荡萃取，然后将该混合物在10000×g条件下离心10min，取有机相到新的离心管，并加入1/10体积的去离子水，振荡后静置分层。最后，将有机相减压浓缩至干，产物用甲醇充分溶解后以高压液相色谱(HPLC)分析。

HPLC检测条件：检测波长254nm，C18反相柱，流速1mL/min，柱温30℃。流动相：水相为5mM乙酸铵溶液，有机相为甲醇，其混合梯度见表1。

表1流动相的混合梯度

HPLC检测结果如图3a、3b和3c所示，根据相关化合物标准品的HPLC图，吩嗪-1-羧酸(PCA)的出峰时间为2.8min，PCN的出峰时间为11.7min，2-羟基吩嗪的出峰时间为14.4min。将phzH基因替换为phzO基因后，菌株HT66-O的发酵液中化合物PCN消失，而2-羟基吩嗪化合物出现。

实施例3

本实施例涉及绿针假单胞菌基因工程菌合成2-羟基吩嗪，具体步骤为：

将绿针假单胞菌HT66和HT66-O分别在固体KB平板充分活化，然后挑取一环接种到装有5mL KB液体培养基的小瓶中，置于28℃、180rpm的摇床转速下培养12h；再按1％比例放大接种到装有50mL KB液体培养基的250mL三角瓶中，于28℃、180rpm的条件下发酵培养。定时取样，用分光光度计测波长600nm处的光密度值，即OD600，用以表示细菌生长情况，并绘制菌株的生长曲线(如图4)。结果表明，将基因phzH替换为phzO后，菌株的生长并未发现明显的变化，有利于继续合成吩嗪化合物。

将发酵液样品进行预处理后以HPLC分析，测定其中吩嗪化合物的产量，吩嗪-1-羧酸和2-羟基吩嗪的产量分别如图5和图6所示。结合图3的分析结果可知，当phzH基因替换为phzO基因后，菌株HT66-O的发酵液中吩嗪化合物的总量及2-羟基吩嗪的产量均高于绿针假单胞菌GP72发酵液中对应的吩嗪产量，表明该基因工程菌有利于进行2-羟基吩嗪的制备。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。