一种酯酶及其应用的制作方法

本发明克隆表达了一种酯酶，并公开了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶学性质和应用，属于工业微生物领域。

背景技术：

阿魏酸酯酶(Feruloyl esterases，FAEs)又称肉桂酸酯酶，它是一种羧酸酯酶，是能水解阿魏酸甲酯、低聚糖酯酶和多糖阿魏酸酯中的酯键，释放游离阿魏酸的酶。它能切断细胞壁中多糖-多糖、多糖-木质素间的交联，有利于细胞壁物质中多糖的降解和木质素的释放，因此在食品、饲料和造纸工业具有广阔的应用前景。在食品工业中，利用酯酶来降解植物细胞壁中的阿魏酸酯键，可以得到有药用价值和保健功能的游离阿魏酸。而植物性原材料通过酯酶的处理使细胞壁变得疏松，作为饲料工业的原料更容易被禽畜消化利用，作为制浆造纸工业的原料可以减少制浆工序化化学药品的使用，减少污染，并有利于后续工序的进行。

1987年，阿魏酸酯酶在Streptomyces olivochromogenes中被第一次发现。研究表明真菌、细菌、酵母都能分泌阿魏酸酯酶，目前发现的产酶微生物有黑曲霉(Aaspergillus niger)，链霉菌(Streptomyces avermitilis)，梭菌(Clostridium thermocellum)，乳酸杆菌(Lactobacilli sp.)，假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)等，但绝大多数阿魏酸酯酶是从真菌中分离出来的。研究发现一些乳酸杆菌有较强的阿酸酯酶活性，并且已经从中克隆表达出阿魏酸酯酶的基因(Wang,X.K.,et al.(2004)."Purification and characterization of a feruloyl esterase from the intestinal bacterium Lactobacillus acidophilus."Appl Microbiol Biot 70(4):2367-2372；Biochemical Properties of Two Cinnamoyl Esterases Purified from a Lactobacillus johnsonii Strain Isolated from Stool Samples of Diabetes-Resistant Rats，Appl Microbiol Biot，2009，5(15)，5018–5024；)。之前有报道芽孢杆菌也有阿魏酸酯酶活性(J.DonaghyáP.F.KellyáA.M.McKay(1998)."Detection of ferulic acid esterase production by Bacillus spp.and lactobacilli."Appl Microbiol Biotechnol 50:257-260)，但未有相关的基因及蛋白序列报道。我们在前面的三个专利(201610158987.9,201610154877.5,201610154846.X)中已经公布了解淀粉芽孢杆菌中的相关基因序列。本专利进一步公开了一株芽孢杆菌中的一种新型阿魏酸酯酶。与NCBI数据库比对发现，该酯酶与短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)中的假设的酯酶相似度最高。

技术实现要素：

本发明从芽孢杆菌中克隆得到了一个新型的酯酶基因，利用大肠杆菌工程菌异源表达，公开了其相关的酶学特性。并用它进行了阿魏酸提取的应用。

本发明的技术方案如下：

1、菌株

本发明酯酶基因的来源菌株为：Bacillus sp.SYBC hb4(由中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号CCTCC NO:M2015018)。

2、酯酶基因的克隆

提取Bacillus sp.SYBC hb4菌体基因组总DNA。设计特异性引物，应用PCR方法，扩增出酯酶基因全长编码框序列。并构建重组质粒。

3、酯酶表达与纯化

将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)中，诱导表达。菌体破碎后得到粗酶液，纯化后冷冻干燥备用。

4、酯酶酶学性质

以阿魏酸甲酯为底物研究pH对本发明所述酯酶酶活的影响。

以阿魏酸甲酯为底物研究温度对本发明所述酯酶酶活的影响。

以阿魏酸甲酯为底物测定了Ca²⁺、K⁺、Na⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Ni⁺、Co⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺等离子对酶活的影响。

酯酶的底物特性分析：所用的底物有乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、葵酸乙酯、乙酸乙烯酯、三甲基乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、甲基丙烯酸乙烯酯、正丁酸乙烯酯、巴豆酸乙烯酯、乙烯葵酸酯、月桂酸乙烯酯、苯甲酸乙烯酯、乙酸异丙烯酯、乙酸异丁酯、乙酸丁酯、乙酸香叶酯、乙酸苯酯、乙酸-1-萘酯、乙酸-2-萘酯、三-O-乙酰基-D葡萄烯糖、α-D(+)五乙酰葡萄糖、乳酸甲酯、己酸甲酯、辛酸甲酯、二氢茉莉酮酸甲酯、溴乙酸甲酯、2-溴丙酸甲酯、溴苯乙酸甲酯、甲基扁桃酸酯、(R)-(-)-扁桃酸甲酯、2，6-二羟基-4-甲基苯甲酸甲酯、4-硝基-苯基乙酸、4-硝基苯丁酸酯、4-硝基苯基辛酸酯、阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯、咖啡酸乙酯、咖啡酸苯乙酯、对香豆酸甲酯、绿原酸、肉桂酸卞酯。

酶活测定方法为：20mM磷酸缓冲液，20ug/ml冷冻干燥的纯酶，1mM底物，水浴控温反应30min，沸水浴100℃加热3分钟终止反应。用高效液相色谱检测底物减少量，高效液相色谱检测条件为：0-15min 10-100％乙腈、90-0％水(0.1％甲酸)；15-20min 100％乙腈、0水；20-30min 10％乙腈、90％水(0.1％甲酸)，检测器为Alltech 3300型蒸发光散射检测器。温度、pH、离子、底物的影响均采用该体系。

5.研究该脂酶对自然底物去淀粉麸皮的活性。

去淀粉麸皮按照文献的方法制备(Xylan-hydrolysing enzymes from Streptomyces spp.Enzyme Microb Tech，1988，10(7):403–409.)。麸皮中阿魏酸的总量以碱法提取得到的阿魏酸计算(Preparation of ferμlic acid from agricμltural wastes:Its improved extraction and purification.Journal of Agricμltural and Food Chemistry，2008，56(17):7644–7648.)。阿魏酸释放率为阿魏酸的酶解释放量占碱提取的阿魏酸总量的百分率

具体实施方式

实施例1

本实施例为本发明所述酯酶基因的克隆与大肠杆菌工程菌构建。

1、Bacillus sp.SYBC hb4DNA的提取

将Bacillus sp.SYBC hb4菌株在LB培养基中培养12小时，12,000rmp/min离心10分钟得到菌体，应用细菌基因组DNA抽提试剂盒(TaKaRa公司)按照其操作提取Bacillus sp.SYBC hb4菌体基因组总DNA，放冰箱备用。

2、大肠杆菌感受态制备

(1)接种E.coli DH5α和BL21(DE3)分别于含有20mL LB培养基的250mL摇瓶中，37℃、200rpm/min培养过夜。

(2)按1％接种量接种于50mL LB培养基中，37℃培养至OD600约0.6(约2～3h)。

(3)将菌液转移到50mL预冷的离心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4℃离心5min。

(4)弃上清，加入5mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，使菌体悬浮，冰上放置20min，8000rpm/min、4℃离心5min。重复2次。

(5)弃上清，加入1.5mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液，含有15％的甘油，轻轻悬浮菌体，然后100μL分装到1.5mL离心管中，-70℃冰箱保藏备用。

3、酯酶基因的克隆

(1)引物设计

分析Bacillus sp.SYBC hb4的全基因组DNA，与NCBI数据库中已知的约氏乳酸杆菌酯酶对比，设计引物序列为：

引物1：5'GCCGGGATCC ATGAAAGTTGTTACACCAAAACC 3'

引物2：5'GCCGTCTAGA TTAAATTGACCAATCGAGTGATTC 3'

(2)PCR扩增

用以上合成的两条引物，以Bacillus sp.SYBC hb4的基因组DNA为模板进行PCR扩增。

本步骤中扩增体系为：

扩增程序为：

94℃，10min

94℃，30sec；55℃，30sec；72℃1min反应30个循环

72℃，10min

PCR产物送华大基因测序后得到该酯酶的基因序列，如SEQ ID NO:1所示。根据该基因序列得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

(3)双酶切和连接

将pCold-Ⅱ质粒和PCR产物进行双酶切，酶切体系为：10×cut buffer 3μl，DNA 4μl，酶Bam H I和Xba I各0.5μl，无菌水2μl共30μl。37℃水浴中切1h。将DNA片段克隆到pCold-ⅡVector上，并转化到E.coli DH5α感受态细胞中。连接体系：10×DNA ligase buffer 2.5μl，DNA片段8μl，载体DNA 2μl，T4 DNA ligase 1μl，无菌水11.5μl共25μl。16℃水浴下连接12h-16h。

(4)转化

步骤：

1在连接体系中加入100μl DH5α感受态细菌，轻混匀，冰浴30min。

2放入预热的42℃水浴中，放置90s进行热休克处理。

3立即冰浴2min。

4加入1ml不含抗生素的LB培养液，37℃培养1h使菌复苏。

5均匀的涂布在含抗生素的LB培养基上。

6培养24h长势良好。挑单菌落进行菌落PCR，核酸电泳验证，提取重组质粒。将重组质粒导入BL21大肠杆菌感受态中，保存备用。

实施例2

本实施例为本发明所述酯酶的诱导表达及分离纯化。

11、加500μl重组菌液到50ml摇瓶。37℃培养2.5h，15℃下静置0.5h。再加20μl 0.5M的IPTG，15℃下冷诱导培养24h。将发酵液进行离心(8,000rmp/min，10min)得到菌体，用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液(20mmol/L，pH7.0)复溶菌体，超声破碎仪破碎，离心(8,000rmp/min，10min)收集上清得到粗酶液。

2、将步骤1得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白纯化系统操作进行镍柱纯化，洗脱方法为：将A1、A2、B1、B2四根管路都放进水里，设置system flow 20ml/min流速，进行排气。然后设置system flow 1ml/min、flow path(column position 3)、delta pressure 0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0、inset A1，待水滴均匀流出后装柱子，平衡十分钟之后把A1放进结合液中，B1放进洗脱液中，再进行排气一次，平衡二十分钟，然后上样粗酶液，用500mM的高浓度咪唑缓冲液B1梯度洗脱目的蛋白，将吸附在离子柱上的蛋白洗脱下来，收集有酶活的洗脱液用超滤管(30-kDa)进行浓缩，得到纯化的酶。纯化后的酶经冷冻干燥备用。

实施例3

本实施例为本发明所述酯酶的最适温度及温度稳定性。以阿魏酸甲酯为底物，将底物与pH为7.0的磷酸缓冲液在25-70℃不同的温度条件下水浴1h测定酯酶的酶活，确定酶的最适反应温度为40℃。

实施例4

本实施例为本发明所述酯酶的最适pH值及pH稳定性。以阿魏酸甲酯为底物，将底物在pH3-9，35℃水浴1h测定酯酶的酶活，结果发现在pH 6.5条件下测得的酯酶酶活最高。

实施例5

本实施例为不同金属离子对酯酶酶活的影响。将实施例中纯化得到的酶置于浓度为1mM的不同金属离子的2ml溶液中30分钟后测定其剩余酶活发现Fe²⁺，Zn²⁺、Cu²⁺和Ni⁺作用1h后，酶活损失较大，Ca²⁺、K⁺、Na⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Co⁺促进酶活上升。结果如表1所示。

表1金属离子对BpFae07酶活性的影响

实施例6

本实施例为酯酶与不同底物的反应特性，列于表2中。由表2可以看出，该酯酶具有广泛的底物，对于芳香羟基肉桂酸脂类族酯类表现出了很强的活力，属于阿魏酸酯酶。

表2 BpFae07酯酶对不同底物的活性

实施例7

本实施例为酯酶水解去淀粉麸皮产阿魏酸的应用。200g麸皮，加入纯化并冷冻干燥后的酯酶40mg，加水1000ml，pH自然，40℃保温12小时，测定得阿魏酸的释放率为63.2％。