一种EZH2蛋白的表位肽及其应用的制作方法

文档序号:12342407阅读:449来源:国知局
一种EZH2蛋白的表位肽及其应用的制作方法与工艺

本发明涉及一种肽,尤其涉及一种EZH2-CTL表位肽及其应用。



背景技术:

多发性骨髓瘤是造血系统来源于B细胞的恶性肿瘤,在美国多发性骨髓瘤是排在非霍奇金淋巴瘤之后发病率第二的血液系统恶性肿瘤,它占所有肿瘤的1%及血液系统恶性肿瘤的13%。多发性骨髓瘤是由浆细胞在骨髓内的恶性克隆性增殖并侵润引起,最终导致高丙种球蛋白血症、免疫机能下降及各靶器官损害。对于大多数患者而言这种疾病是无法治愈的。接受常规化疗患者的中位生存在3-4年,而在接受自体外周血造血干细胞移植后,有50%的患者可以达到完全缓解,这些患者的中位生存可以延长到5-7年。但是,绝大部分患者最终会复发。

目前认为这些患者复发的根源是因为体内存在微小残留病灶,因此,需要一种有效的方法,能使接受化疗或自体造血干细胞移植之后患者体内的微小残留病灶被有效清除。

免疫治疗就是一种非常合适的选择。骨髓瘤细胞分泌的独特型抗原是一种肿瘤特异性抗原。有学者用这种独特型抗原给多发性骨髓瘤患者接种以进行免疫治疗,但是这种治疗疗效让人失望,一部分原因被归咎于这种独特型抗原的免疫原性不够强。因此,我们迫切的需要发现一种大部分患者共有的新型的肿瘤抗原来改善免疫治疗对多发性骨髓瘤的疗效。理想的肿瘤抗原应该在不同起源的肿瘤细胞表明表达,在正常组织中低表达或者不表达,而且在肿瘤细胞的生长及生存中不可或缺,这样肿瘤细胞才不可能通过不表达或者下调表达该抗原以逃避免疫攻击。

免疫治疗一直是医学领域研究的热点,众多研究者寻找到许多多发性骨髓瘤的靶点,比如热休克蛋白(HSP)、未折叠蛋白(XBP1)及CD138+等,但这些靶点都有各自的局限性,比如CD138+理论上表达于所有骨髓瘤细胞表面,但是近期的一些研究却认为,骨髓瘤干细胞可能存在于一群CD138-的细胞中,而XBP1及Hsp在患者中的表达率也无法达到100%。这就需要我们不断寻找新的骨髓瘤治疗靶点,以最终达到个体化治疗的目的,即:对于每位患者检测其体内各种肿瘤抗原的表达情况,根据其强弱选择合适的靶点,以达到最佳的治疗效果,这种个体化的有差异的治疗也许是今后肿瘤免疫治疗的发展方向。



技术实现要素:

本发明提供了一种EZH2表位肽,以及所述表位肽的应用。

本发明第一个方面是提供一种EZH2表位肽,所述表位肽含有、并优选组成为如下序列:

1)YMCSFLFNL(SEQ ID No.1);或者

2)序列1)经过取代、缺失、或添加一个或多个氨基酸、且具有EZH2抗原表位肽功能的氨基酸序列。

本发明第二个方面是提供所述EZH2表位肽的应用,所说应用包括制备药物、疫苗中的应用。

其中,所述药物或疫苗以所述EZH2表位肽为作用靶点。

其中,所述药物或疫苗为治疗/预防肿瘤的药物。

所述肿瘤优选为至少包括前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌及血液肿瘤(如淋巴瘤和骨髓瘤等)。

更优选地,所述药物为治疗骨髓瘤和/或血液肿瘤的药物。

其中,所述疫苗为预防骨髓瘤和/或血液肿瘤的疫苗。

其中,所述药物和/或疫苗还可以包括佐剂、辅料。

在本发明一种优选实施例中,所述EZH2表位肽诱导的CTL细胞作为药物的全部或部分活性成分。

本发明还提供一种所述EZH2表位肽诱导的CTL细胞(EZH2-CTLs)。

本发明提供了一种EZH2表位肽,该EZH2表位肽能够诱导出EZH2-CTLs,在体外试验中有明确杀伤HLA-A0201+骨髓瘤细胞作用,并且对正常造血细胞没有杀伤。

附图说明

图1 EZH2肽段与T2细胞结合力预实验结果,A为EZH2肽段与其他肽对T2细胞结合力对比预实验结果,B为EZH2肽段与其他肽对T2细胞结合稳定性预实验结果;

图2为健康供者及患者外周血中EZH2-CTLs水平测定;

图3为T细胞增殖实验;

图4为乳酸脱氢酶释放试验检测EZH2-CTL对靶细胞杀伤作用;

图5为EZH2-CTLs细胞杀伤骨髓瘤细胞时的脱颗粒作用。

具体实施方式

EZH2蛋白氨基酸序列(SEQ ID No.3),Genbank登录号为:AAC51520.1,如下所述:

mgqtgkksek gpvcwrkrvk seymrlrqlk rfrradevks mfssnrqkil erteilnqew kqrriqpvhiltsvsslrgt recsvtsdld fptqviplkt lnavasvpim yswsplqqnf mvedetvlhn ipymgdevldqdgtfieeli knydgkvhgd recgfindei fvelvnalgq yndddddddg ddpeereekq kdledhrddkesrpprkfps dkifeaissm fpdkgtaeel kekykelteq qlpgalppec tpnidgpnak svqreqslhsfhtlfcrrcf kydcflhpfh atpntykrkn tetaldnkpc gpqcyqhleg akefaaalta eriktppkrpggrrrgrlpn nssrpstpti nvleskdtds dreagtetgg enndkeeeek kdetssssea nsrcqtpikmkpnieppenv ewsgaeasmf rvligtyydn fcaiarligt ktcrqvyefr vkessiiapa paedvdtpprkkkrkhrlwa ahcrkiqlkk dgssnhvyny qpcdhprqpc dsscpcviaq nfcekfcqcs secqnrfpgcrckaqcntkq cpcylavrec dpdlcltcga adhwdsknvs ckncsiqrgs kkhlllapsd vagwgifikdpvqknefise ycgeiisqde adrrgkvydk ymcsflfnln ndfvvdatrk gnkirfanhs vnpncyakvmmvngdhrigi fakraiqtge elffdyrysq adalkyvgie remeip

本发明提供了两种EZH2表位肽:YMCSFLFNL(SEQ ID No.1)、SQADALKYV(SEQ ID No.2)。

表1,EZH2表位肽及其与人HLA-A0201亲和力预测积分

表1中:a:NIH BIMAS http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind

b:SYFPEITHI http://www.syfpeithi.de/

本发明选取合成了两条HLA A0201阳性肽HIV-1pol肽段(序列:ILKEPVHGV)、流感病毒基质蛋白肽段(序列:GILGFVFTL)作为本实验的阳性对照。

T2细胞表位肽结合亲和及稳定性实验

1)T2细胞亲和实验

收集T2细胞,用4℃的无菌PBS离心洗涤三次,加入无血清1640培养基,2×105/孔细胞接种于24孔细胞培养板中,设立实验组及对照组,每组重复三个副孔,将未加肽刺激的T2细胞作为空白对照,每孔加入相应的候选肽段及对照肽段(终浓度50uM),同时加入β2微球蛋白(终浓度2.5ug/ml),将细胞置于37℃,5%CO2培养箱中孵育18h,再次收集细胞,4℃、PBS洗涤三次,加入FITC标记的HLA-A0201单克隆抗体BB7.2(2ul/孔),4℃避光孵育15分钟,4℃、PBS洗涤3次,流式细胞仪检测平均荧光强度。

用荧光指数(FI,荧光系数)作为衡量亲和力指标,荧光系数>1的表位肽被认为与HLA-A0201分子具有高亲和力,荧光系数由以下公式计算得到:

用荧光指数(FI)=(样本平均荧光强度-空白对照平均荧光强度)/空白对照平均荧光强度

参照图1A,YMCSFLFNL序列(aa661)荧光系数大于1,达到1.4左右,说明该表位肽与HLA-A0201亲和力高。

2)T2细胞表位肽结合稳定性实验

收集T2细胞,1×105/孔接种于96孔细胞培养板中,加入无血清1640培养基、β2微球蛋白、以及相应的候选肽段及对照肽段,将细胞置于培养箱中孵育18h,再次收集细胞,洗涤后加入无血清1640培养基、胞外布雷菲德菌素共同孵育1h,收集细胞,洗涤后再次加入含有胞外布雷菲德菌素(0.5ug/ml)的无血清1640培养基,放入培养箱中孵育,于不同的时间点(0,2,4,8,12,24h)收集细胞。每一个实验组设置三个副孔,加入FITC标记的HLA-A0201单克隆抗体BB7.2,流式细胞仪检测平均荧光强度,计算出每点的FI,用此衡量表位肽诱导的HLA-A0201的表达情况。

参照图1B,各个时间点上,YMCSFLFNL序列(aa661)荧光系数均明显高于aa729序列,因此与HLA-A0201结合稳定。

在健康供者及患者体内检测所筛选肽段相应五聚体阳性细胞毒性T细胞(CTLS)

收集健康供者及两名多发性骨髓瘤确诊未缓解患者外周血5ml,用淋巴细胞分离液分离方法提取外周血单个核细胞,将细胞计数后取1×106个细胞,溶于100ulPBS中,加入2ul所筛选表位肽对应的PE标记的五聚体及同型对照,常温避光孵育40分钟,后冰面放置1分钟,加入FITC标记的CD8+单克隆抗体,4℃避光15分钟,取出后以4℃PBS洗3次,用500ulPBS重悬后用流式细胞仪进行检测。

参照图2,健康供者体内EZH2-CTLS水平明显低于骨髓瘤患者,说明,本发明表位肽是生理状态下产生的表位肽片段。

体外验证EZH2蛋白特异性细胞毒性T细胞对骨髓瘤细胞细胞溶解作用

1)诱导生成细胞毒性T细胞:包括HLA-A0201+健康供者外周血单个核细胞分离、DC细胞诱导培养、细胞毒性T细胞诱导培养。

1.1)获取HLA-A0201+健康供者外周血单个核细胞

1.2)诱导生成DC细胞

(1).将提取的单个核细胞按照每孔1×106个加入24孔板中静置2h,使单核细胞贴壁。

(2).吸尽24孔板中的细胞悬液,并用含有10%FBS的1640培养基0.5ml轻轻冲刷每孔。

(3).每孔加入含有GM-CSF及IL-4 10的培养基。

(4).每3日半量换液一次,加入GM-CSF及IL-4,第5日半量换液,加入GM-CSF 10、IL-4 10及TNF-α10,48h后DC细胞成熟。

(5).加入EZH2肽段静置2-4h。

(6).30Gy伽马射线照射成熟的DC细胞。

(7).吸除所有上清,加入淋巴细胞或者诱导的CTL细胞。

1.3).PBMC来源CTLs的产生

(1).淋巴细胞与DC细胞共培养时,加入有IL-2 50IU/ml、IL-7 2.5ng/ml及IL-15 5ng/ml的10%FBS的1640培养基,将淋巴细胞计数后与成熟DC细胞按照10:1比例混合。

(2).每2-3日半量换液一次,同时加入IL-2、IL-7及IL-15。

(3).第7日将淋巴细胞移入新生成DC孔中并与之共培养。

(4).每次与新的DC细胞共培养前,需取样检测特异性。

1.4)CTL细胞CD8及五聚体双阳性率的检测

(1).取5×105个培养的CTL细胞离心后以100ul无菌PBS重悬。

(2).用带有荧光标记的MHC/肽多聚体(Epimer)标记细胞后加入抗-CD8-FITC。

(3).PBS洗涤液洗细胞后重悬于适量PBS洗涤液中。

(4).细胞流式仪分析。

2)CTL细胞表型测定:

(1).取3×106个培养的CTL细胞,同时取未经过与DC共培养的外周血PBMC作为对照组。

(2).用带有荧光标记的MHC/肽多聚体(Epimer)标记后加入抗-CD8-FITC及抗-CD45RA-APC或抗CD45RO-APC。

(3).PBS洗涤液洗细胞后重悬于适量PBS洗涤液中。

(4).细胞流式仪分析。

3)CTL细胞增殖实验:取经过与DC细胞共培养四周的CTLs细胞进行实验:

a、取10×106个培养的CTL细胞,加入无菌PBS5ml,以1000转10分钟离心,弃上清,以10ml无菌PBS重悬,使其达到每1ml有1×106个细胞。

b、加入CFSE使其终浓度为3μM,放入37℃二氧化碳培养箱孵育15分钟,每5分钟摇匀细胞。

c、取出细胞后加入等量胎牛血清放入4℃冰箱终止10分钟。

d、用PBS洗涤三次,每次为1000转10分钟。

e、用含有10%FBS的1640重悬,使细胞浓度达到1×106/ml。

f、将细胞分组移入24孔培养板中,每孔CTL细胞为1×106个。A组为空白CTL细胞,B组为CTL细胞按10:1比例加入(HLA-A0201+骨髓瘤细胞株),C组为CTL细胞按10:1比例加入(HLA-A0201-骨髓瘤细胞株),每组设3个复孔。

g、96小时后收集三组细胞即9孔,用PBS洗涤两次,每次为1000转10分钟,后进行流式细胞检测。

4)CTL细胞因子分泌测定:

a、取经过与DC细胞共培养四周的EZH2-CTLs 1×106个细胞进行实验,每组设3个副孔;

b、将培养基(包含细胞)移入10ml无菌离心管中,以1000转10分钟离心;

c、将上清培养基吸出,与捕获微球共孵育,加入包被了抗体的微球混合物孵育2h,以PBS洗涤;

d、加入标记生物素荧光探测试(PE标记)剂孵育1h,以PBS洗涤;

流式细胞仪上机检测;

e、用FlowCytomix Pro软件计算被测样本中相应细胞因子的浓度。

5)CTL细胞杀伤实验:取经过与DC细胞共培养四周的CTLs细胞进行实验:

a、取10×106个培养的CTL细胞,调整浓度至1×106个细胞/ml。

b、加入CFSE使其终浓度为3μM,放入37℃二氧化碳培养箱孵育15分钟。

c、取出细胞后加入等量胎牛血清放入4℃冰箱终止10分钟。

d、用无菌PBS洗涤三次。

e、用含有10%FBS的1640重悬,使细胞浓度达到1×106/ml。

f、将细胞分组移入24孔培养板中,每孔CTL细胞为1×106个。设置空白CTL细胞组,ARH-77(HLA-A0201+骨髓瘤细胞株)组,及LP1(HLA-A0201-骨髓瘤细胞株)组。

g、效靶细胞混合培养4小时后混合离心;

h、重悬后避光加入PI,4℃避光15分钟后上流式细胞仪进行检测。

6)EZH2-CTLs细胞功能测定:

6.1.CTLs与HLA-A0201+靶细胞混合实验测定CD107a表达情况(该实验重复三次):

a、取1×106个培养的CTLs细胞;

b、取2×106个培养的(HLA-A0201+)多发性骨髓瘤细胞;

c、将CTL细胞与靶细胞混合。

d、将效靶细胞混合液放入V型底96孔培养板中。

e、将放有细胞的96孔板放入37℃5%二氧化碳培养箱中,培养4小时。

f、培养4h后取出培养板,吹匀并吸出每孔细胞悬液,将10孔细胞混合。

g、以100ul无菌PBS重悬效靶细胞混合液,加入2ul抗-CD8-FITC及10ul抗-CD107a-PC5。

h、用无菌PBS洗涤液洗细胞后重悬。

i、用流式细胞仪进行检测。

6.2.CTLs与HLA-A0201-靶细胞混合实验测定CTLs细胞CD107a表达情况(该实验重复三次):

a、取1×106个培养的CTLs细胞,以1000转10分钟离心,弃上清,用含有10%FBS的1640重悬,使体积为333ul。

b、取2×106个培养的(HLA-A0201-)多发性骨髓瘤细胞,以1000转10分钟离心,弃上清,用含有10%FBS的1640重悬,使体积为667ul。

c、将CTLs细胞333ul与靶细胞667ul混合,共1ml。

d、将效靶细胞混合液放入V型底96孔培养板中,每孔100ul,共10孔。

e、将放有细胞的96孔板放入37℃5%二氧化碳培养箱中,培养4小时(对96孔板进行离心1000转5分钟)。

f、培养4h后取出培养板,吹匀并吸出每孔细胞悬液,将10孔细胞混合。

g、向效靶细胞混合液中加入5ml无菌PBS,混匀后以1000转10分钟离心,弃上清。以100ul无菌PBS重悬效靶细胞混合液,加入2ul抗-CD8-FITC及10ul抗-CD107a-PC5在冰上避光反应20分钟。

h、用无菌PBS洗涤液洗细胞3次,400xg 5分钟,细胞沉淀重悬于500ulPBS中。

i、用流式细胞仪进行检测。

参照图3,经过本发明肽刺激的DC细胞(pulsedDC)具有诱导相应EZH2-CTLS细胞增殖的能力,OD值明显高于未经本发明肽刺激的DC细胞(unpulsedDC)。

抗原特异性CTLS细胞表达CO45RO和CD45RA情况如下:

CD8+CD45RA-细胞占所有CTLS细胞88%。

CD8+CD45RO+细胞占所有CTLS细胞90%。

细胞因子测定结果如表2所示。

表2,细胞因子测定结果

EZH2-CTLs对骨髓瘤杀伤作用

参照图4,细胞毒性分析表明,CTLS可特异性杀伤HLA-A0201阳性骨髓瘤细胞株及原代细胞,而对HLA-A0201阴性骨髓瘤细胞株无杀伤作用

为了衡量EZH2-CTLs细胞杀伤骨髓瘤细胞株的效能,借助测量CD107a在EZH2-CTLs细胞表面的表达,评估其细胞杀伤骨髓瘤细胞时的脱颗粒作用,如图5所示,CD107a在EZH2-CTLs细胞释放细胞毒颗粒时会短暂的在CTLs细胞膜表面表达。

上述实验证明,本发明提供了一种新型的肿瘤特异性抗原的CTL表位肽,其能够诱导出EZH2-CTLs,证实其在体外试验中有明确杀伤HLA-A0201+骨髓瘤细胞作用,并且对正常造血细胞没有杀伤,可以作为靶点达到体内/体外杀伤骨髓瘤细胞的目的。

同样的,由于EZH2在其他众多肿瘤(如前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、血液肿瘤、淋巴瘤等)中都有高表达,与肿瘤的恶性进程、侵袭性、转移能力关系密切,因此该EZH2表位肽也可以作为靶点治疗/预防前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌及其他血液肿瘤如淋巴瘤等多种肿瘤。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述,但其只是作为范例,本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言,任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此,在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改,都应涵盖在本发明的范围内。

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