一种用乙酸制取大豆阿格拉欣家族肽的制备方法与流程

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用乙酸制取大豆阿格拉欣家族肽的制备方法。

（二）

背景技术：

阿格拉欣（Aglycin）原是以大豆种子为原料提取鉴定出的生命活性物质。经研究发现，阿格拉欣家族的主要有效成分是4个生物活性肽。这4个生物活性肽都由一级结构相近的37个氨基酸残基组成，都有位点相同的6个半胱氨酸残基。这6个半胱氨酸残基构成胱氨酸结(Cystine knot) 的结构域(structural domain)，使得这4个肽对消化道蛋白酶相对稳定，能口服发挥其生物学功能。中文名为阿格拉欣，英文名为Aglycin，阿格拉欣家族肽中4个肽的氨基酸组成分别为：

1. ASCNG VCSPF EMPPC GSSAC RCIPV GLVVG YCRHP SG ；

2. ISCNG VCSPF DIPPC GTPLC RCIPA GLFVG KCRHP YG ；

3. VSCNG VCSPF DIPPC GTPLC RCIPY GLFVG NCRHP YG ；

4. VSCNG VCSPF EMPPC GSSAC RCIPY GLVVG NCRHP SG。

从豆类植物中直接提取是获得阿格拉欣家族肽的主要来源，然而，已有的提取方法中所获得的阿格拉欣家族肽的含量较低，活性低，且提取步骤繁琐。

（三）

技术实现要素：

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种用乙酸制取大豆阿格拉欣家族肽的制备方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种用乙酸制取大豆阿格拉欣家族肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）原料清洗：往1吨大豆中加入4-6倍体积的去离子水清洗三次；

（2）浸泡：将清洗好的大豆放入容器中，加入4-5倍无离子水，温度为30-35℃，浸泡时间为5-7小时，然后把水排出；

（3）萌发：将浸泡好的大豆放在种子萌发培养箱内，厚度为2公分，温度控制在20-25℃，每间隔2小时用20-25℃的去离子水冲洗一次，萌发时间为9-11小时；

（4）磨浆提取：将萌发好的大豆加入4-5倍的去离子水用胶体磨进行磨浆，加入50L醋乙酸，提取温度：10℃，提取时间为8小时；

（5）渣浆分离：将步骤（4）中提取好的物料进行渣浆分离；

（6）陶瓷膜：将步骤（5）中分离好的清液进行陶瓷膜过滤；

（7）将陶瓷膜过滤的清液用1500D的有机膜过滤收集,再用6000D有机膜过滤,从而更多的获得分子量1500D-6000D之间的小蛋白及阿格拉欣肽类化合物；

（8）冷冻干燥：将收集的有机膜截留液以每盘按照500ml进行冷冻干燥，干燥时间48小时即得阿格拉欣产品。

其中，步骤（2）中的浸泡时间为6小时。

其中，步骤（3）中的萌发时间为10小时。

其中，步骤（4）中乙酸浓度为0.8-1%。

其中，步骤（6）中陶瓷膜孔径为0.1微米。

上述用乙酸制取大豆阿格拉欣家族肽的制备方法得到的产品应用于制备预防或治疗糖尿病药物或组合物中。

进一步，所述糖尿病为2型糖尿病。

阿格拉欣家族肽有如下独特的生物学功能，使之可开发为口服治疗2型糖尿病的多肽药物：1.它激活胰腺beta细胞基因转录和翻译而合成胰岛素； 2.在高血糖（＞8.0 mmol/L）条件下，它在体内刺激胰岛素分泌而使血糖下降；3.它对胰腺有保护作用，也能使受损害的胰腺组织得到功能恢复。

迄今，我们已发现的作用机理是：1.它通过分布在细胞膜上L型钙离子通道，诱导胰腺beta细胞微环境中外钙内流，并驱动该类细胞分泌胰岛素；2. 它是通过胰岛素受体/胰岛素受体底物1途径来调节机体内血糖平衡；3. 它保护胰腺小岛细胞，防止来自化学和物理及生物因素的破坏，有抗凋亡功能，4. 它促进胰腺生产胰岛素细胞的基因表达，使机体合成和分泌胰岛素。它不但激活胰岛素基因启动子，还能通过IR/ Erk/CREB 途径刺激基础胰岛素分泌。

本发明的有益效果是：工艺操作简单，通过对提取步骤进行优化，使得阿格拉欣家族肽提取彻底。采用陶瓷膜和2次有机膜过滤，便于操作，生产周期短，可实现工业化生产。所生产的阿格拉欣产品淡黄色粉末，口感好，纯度高，37肽含量在20%以上，大大高于常规方案获得的12.9%的纯度。本方案生产获得的阿格拉欣经动物实验检测发现降糖活性较常规生产方法获得的阿格拉欣有很大提高。产品可用于2型糖尿病的辅助治疗和预防。

（四）说明书附图

图1 本发明技术方案制备得到的阿格拉欣家族肽图谱；

图2 常规工艺制备得到阿格拉欣家族肽图谱。

（五）具体实施方式

实施例1：

用乙酸制取大豆阿格拉欣家族肽的制备方法，包括以下步骤：

（1）原料清洗：投入1吨大豆，加入5倍体积的无离子水清洗三次；

（2）浸泡：将清洗好的大豆放入自制的特殊的容器中，加入4倍无离子水，温度为28-30℃，浸泡时间为12小时，然后把水排出；

（3）萌发：将浸泡好的大豆放在种子萌发培养箱内，厚度2公分，温度控制在28-30℃，每间隔2小时用28-30℃的无离子水冲洗一次，萌发时间为6小时；

（4）磨浆提取：将萌发好的大豆加入4倍的无离子水用胶体磨进行磨浆，加入50L醋乙酸，其乙酸浓度为1%，提取温度：10℃，提取时间为10小时；

（5）渣浆分离：将提取好的物料进行渣浆分离；

（6）陶瓷膜：将分离好的清液进行0.1um陶瓷膜过滤；

（7）有机膜：将陶瓷膜过滤的清液用1500D的有机膜过滤收集,再用6000D有机膜过滤,从而更多的获得分子量1500D-6000 D之间的小蛋白及阿格拉欣（Aglycin Peptide)肽类化合物；

（8）冷冻干燥：将收集的有机膜截留液以每盘按照500ml进行冷冻干燥，干燥时间48小时即得阿格拉欣产品；

对获得的阿格拉欣产品进行色谱分析，由图1结果可知，本方案获得的阿格拉欣家族肽四个肽成分占比达到20%，而图2所示常规方案获得的阿格拉欣家族肽四个肽成分占比只有12.9%。相较于常规方案，本方案生产效率得到显著提升。且就四个肽的组成来看，两个方案获得的阿格拉欣家族肽构成也有较大区别，主峰构成和占比有着明显的差别。

实施例2：

用乙酸制取大豆阿格拉欣家族肽的制备方法，包括以下步骤：

（1）原料清洗：往1吨大豆中加入4倍体积的去离子水清洗三次；

（2）浸泡：将清洗好的大豆放入容器中，加入4倍无离子水，温度为30-35℃，浸泡时间为5-7小时，然后把水排出；

（3）萌发：将浸泡好的大豆放在种子萌发培养箱内，厚度为2公分，温度控制在20-25℃，每间隔2小时用20-25℃的去离子水冲洗一次，萌发时间为9-11小时；

（4）磨浆提取：将萌发好的大豆加入4倍的去离子水用胶体磨进行磨浆，加入50L醋乙酸，乙酸浓度为0.8%，提取温度：10℃，提取时间为8小时；

（5）渣浆分离：将提取好的物料进行渣浆分离；

（6）陶瓷膜：将分离好的清液进行陶瓷膜过滤；

（7）将陶瓷膜过滤的清液用1500D的有机膜过滤收集,再用6000D有机膜过滤,从而更多的获得分子量1500D-6000D之间的小蛋白及阿格拉欣肽类化合物；

（8）冷冻干燥：将收集的有机膜截留液以每盘按照500ml进行冷冻干燥，干燥时间48小时即得阿格拉欣产品。

实施例3：

一种用乙酸制取大豆阿格拉欣家族肽的制备方法，包括以下步骤：

（1）原料清洗：往1吨大豆中加入6倍体积的去离子水清洗三次；

（2）浸泡：将清洗好的大豆放入容器中，加入5倍无离子水，温度为35℃，浸泡时间为5-7小时，然后把水排出；

（3）萌发：将浸泡好的大豆放在种子萌发培养箱内，厚度为2公分，温度控制在20-25℃，每间隔2小时用20-25℃的去离子水冲洗一次，萌发时间为11小时；

（4）磨浆提取：将萌发好的大豆加入4-5倍的去离子水用胶体磨进行磨浆，加入50L醋乙酸，乙酸浓度为0.9%，提取温度：10℃，提取时间为8小时；

（5）渣浆分离：将提取好的物料进行渣浆分离；

（6）陶瓷膜：将分离好的清液进行陶瓷膜过滤；

（7）将陶瓷膜过滤的清液用1500D的有机膜过滤收集,再用6000D有机膜过滤,从而更多的获得分子量1500D-6000D之间的小蛋白及阿格拉欣肽类化合物；

（8）冷冻干燥：将收集的有机膜截留液以每盘按照500ml进行冷冻干燥，干燥时间48小时即得阿格拉欣产品。

实施例4：

动物实验评价

1.实验材料

Aglycin，由本发明实施例1制备获得，为黄色粉末。血糖试纸及血糖仪由三诺公司生产，链脲佐菌素由美国Sigma公司生产。SPF级雄性SD大鼠购自青龙山实验动物中心，高脂饲料于汤山龙泉公司定制生产。

2.试验方法

正常动物降血糖实验设一个空白对照组和两个模型组（分别为使用常规方法提取得到的Aglycin和使用本发明实施例1提取到的Aglycin）。

模型组降糖实验设模型对照组，空白对照组，常规方法提取Aglycin的实验组和本方案提取的Aglycin实验组。

3.正常动物血糖安全性实验

选健康成年雄性SD大鼠按禁食6小时的血糖水平分组，随机选取分组，每组8只。对照组给予蒸馏水，剂量组给予受试样品（4.2g/kg*BW体重（以有效成分计），标准剂量30倍），连续30天，测量并比较各组空腹血糖值。

4.链脲佐菌素联合高脂饲料喂养高血糖模型降糖实验

普通维持料适应性喂养3天后禁食6小时，取尾血测定基础血糖值，更换高脂料饲养15天之后禁食12小时后注射链脲佐菌素40mg/kg*BW，7天后禁食6小时，取尾血测空腹血糖，依据血糖水平随机分组。两个受试组给予不同工艺获得的Aglycin，剂量为140mg/kg*BW（以有效成分计），模型对照组与空白对照组给予相同剂量的蒸馏水。35天后空腹处理6小时，测量空腹血糖并于初始血糖和成模血糖比较。

5.数据处理

采用SPSS11.5软件包进行t检验与方差分析。

5.1.正常动物血糖安全性实验数据分析

表1 正常动物血糖安全性实验

表1结果显示三组动物实验前后空腹血糖对比均无显著差异，阿格拉欣对正常SD大鼠无降血糖作用，因此没有低血糖风险，安全性良好。

5.2.链脲佐菌素联合高脂饲料喂养高血糖模型降糖实验数据分析

表2 链脲佐菌素联合高脂饲料喂养高血糖模型降糖实验

表2结果显示，模型对照组实验前后血糖对比没有显著差异，但常规方案组（P<0.05）实验前后血糖对比有显著差异，本方案组（P<0.01）实验前后血糖对比有极其显著的差异，两个方案生产的阿格拉欣都能起到降血糖作用。但常规方案生产的阿格拉欣实验组只降低了3.5mmol/L,而本方案生产的阿格拉欣实验组则降低了6.5mmol/L，降幅明显，且统计学意义上实验前后血糖对比差异更加显著。因此本方案作为改进型的生产方案，所得到的阿格拉欣家族肽在功效上相较于常规生产方案得到了大幅增强。

本发明通过上述实施案例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不仅限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细的工艺设备和工艺流程才能实施。所述技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。