一种氯霉素分子印迹聚合物的制备方法与流程

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种分子印迹聚合物的制备，特别是一种对氯霉素分子具有特异性识别分子印迹聚合物的制备。

背景技术：

氯霉素（chloramphenicol，CAP）是一种广谱性抗生素，有很强的杀菌能力。目前氯霉素已经广泛应用于治疗和预防家禽、家畜及水产品的疾病。但是长期使用可引起再生性障碍性贫血和其他恶性的血液病，如果婴儿长期食用氯霉素污染的乳汁，可能会引起“灰婴综合症”， 动物性食品与水产品中的氯霉素残留对人体健康构成了很大的威胁。欧盟自1994年明确规定禁止在动物性食品中使用氯霉素，氯霉素的残留限量标准为“ 零容许量”，同样欧盟也严格规定肉中的氯霉素残留量不得超过0.1 ng/g。我国也已经禁止将氯霉素及其盐、酯用于食品动物。任何水产品、畜禽产品中氯霉素都是必检项目。因此建立灵敏度高、选择性强、简便易行的动物源性食品氯霉素残留的检测方法是非常有必要的。

目前，氯霉素的检测主要采用微生物法、酶联免疫分析法、放射性免疫法、气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）及质谱（MS）与色谱技术联用（GC-MS、HPLC-MS)的相关检测方法，但是上述方法通常存在预处理繁琐、选择性不高或价格过高等特点。分子印迹技术是一种高选择性的仿生识别方法，以其操作简单、聚合物的选择性好、性能稳定、价格便宜等优点，用于固相萃取、色谱柱填料中。之前已有几篇相关论文报道氯霉素分子印迹聚合物的制备。以氯霉素为模板分子本体聚合制备的印迹聚合物用于传感器（J. L. Suárez-Rodríguez, M. E. Díaz-García, Biosensors & Bioelectronics 16 (2001) 955; M. L. Mena, L. Agüí, P. Martinez-Ruiz, et al., Anal. Bioanal. Chem., 376 (2003) 18）、HPLC和固相萃取（SPE）固定相（C. Schrimer, H. Meisel, J. Chromatogr. A, 1132 (2006) 325; X. Shi, A. Wu, S. Zhang, et al., J. Chromatogr. B, 850 (2007)24; C. Schrimer, H. Meisel, Anal. Bioanal. Chem., 392 (2008) 223; L. Guo, M. Guan, C. Zhao, H. Zhang, Anal. Bioanal. Chem., 392 (2008) 1431）以及结合质谱技术的LC-MS（J. F. Huang, H. J. Zhang, Y. Q. Feng, J. Agri. Food Chem., 54 (2006) 9279）或LC-MS//MS（R. Mohamed, J. Richoz-Payot, E. Gremaud, et al., Anal. Chem., 79 (2007) 9557）检测食品中的氯霉素。但是均使用有机小分子为致孔剂。

离子液体作为一种集绿色、低熔点、宽电化学窗口、可设计具有催化效果于一身的新型溶剂，能溶解很多有机或无机物质，液态范围宽（通常300 ℃时不分解），有较好的热稳定性，在电化学、液-液萃取、分离过程、有机反应催化等领域有着广泛的应用。目前，将离子液体用于分子印迹聚合的文献很少。Wang 等将室温离子液体作为介质用于溶胶-凝胶分子印迹整体柱的制备，并用于分离手性药物S-萘普生(He-Fang Wang, Yi-Zhou Zhu, Xiu-Ping Yan, Ru-Yu Gao, and Jian-Yu Zheng. Adv. Mater.18 (2006) 3266 )。Booker 等以反式乌头酸为模板分子，在离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐和1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐存在下，制备分子印迹聚合物，聚合物的选择性比。

传统方法有明显提高(Kate Booker, Michael C. Bowyer, Clovia I. Holdsworth and Adam McCluskey. Chem. Commun. (2006) 1730。He等利用离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐作为溶剂和致孔剂，采用溶胶-凝胶及牺牲空间法制备了睾丸素的分子印迹聚合物(C. Y. He, Y. Y. Long, J. L. Pan, et al., Talanta,74 (2008) 1126)。Sun等以诺氟沙星为模板、离子液体1-丁基-3-甲基咪唑基四氟硼酸盐([BMIm]BF₄)为致孔剂合成了一种诺氟沙星分子印迹整体柱 （Xiangli Sun, Jia He, Guorui Cai, Anqing Lin, Wenjie Zheng, Xuan Liu, Langxing Chen, Xiwen He, Yukui Zhang, J. Sep. Sci. 33 (2010) 3786)。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种氯霉素分子印迹聚合物的制备方法，制备方法简单、高效，分子印迹聚合物具有良好分散性、易研磨、分子识别选择性能好。可作为固相萃取小柱填料，实现对氯霉素样品预处理中的分离、富集。

本发明的技术方案如下：

本发明提供的氯霉素分子印迹聚合物的制备方法，包括如下步骤：

第一、先将模板分子溶解在离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐和四氢呋喃溶剂中，再加入功能单体与模板分子相互作用30min；形成模板-离子液体-功能单体复合物，再加入交联剂、引发剂混合均匀；

其中，模板分子为氯霉素，功能单体为2-乙烯基吡啶，溶剂离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([BMIM]BF₄) 和四氢呋喃，交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯，引发剂为偶氮二异丁腈。1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐和四氢呋喃的体积之比为1：1-1：2；所述模板分子、功能单体、交联剂的物质的摩尔量之比为1：4：20；溶剂的体积用量与模板分子氯霉素的摩尔量之比为6mL/mmol -12mL/mmol；引发剂质量与模板分子的摩尔量比为40 mg/mmol；

第二、上步混合均匀后，超声脱气，超声作用时间为5min；通入氮气，时间为10-15min；抽真空，在60℃恒温水浴中，发生热引发聚合24小时，得到分子印迹聚合物；

第三、将上步得到的分子印迹聚合物取出研磨、过筛，用有机溶剂除去模板分子，通过紫外检测器直至检测不出模板分子；真空干燥，得到氯霉素分子印迹聚合物。

第三步研磨过筛后形成平均粒径为300-700 nm的聚合物；使用的有机溶剂为甲醇和乙酸的体积比为90：10的混合溶液；真空干燥前的聚合物用乙腈清洗三至五次，除去残余的甲醇和乙酸。

真空干燥温度为60℃，控制时长为24小时。

本发明的优点和积极效果：

本发明制备的氯霉素分子印迹聚合物为比较均匀的球状结构，与传统的以四氢呋喃有机溶剂相比，采用离子液体和四氢呋喃为混合溶剂具有如下的优点：

1、以离子液体和四氢呋喃为混合溶剂，，在合成的过程中离子液体对聚合物反应有很好的催化效果，另外还起到致孔剂的作用，得到的分子印迹聚合物粒径在纳米级，粒径为300-700 nm。

2、合成的聚合物较之传统致孔剂合成的聚合物松软、易研磨且孔径及颗粒较均匀。

3、分子印迹聚合物的选择识别性能优于传统方法。

从应用价值考虑，本发明所提供的氯霉素分子印迹聚合物可作为固相萃取小柱的填料萃取剂，实现对氯霉素的选择性分离、富集和纯化，克服目前通用色谱检测方法杂质干扰严重的缺点。

附图说明

图1为离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸：四氢呋喃（1:1 V/V)为溶剂合成的分子印迹聚合物的形态扫描电镜图；

图2为离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸：四氢呋喃（2:1 V/V)为溶剂合成的分子印迹聚合物的形态扫描电镜图。

具体实施方式

实施例1：

首先称取0.25mmol模板分子氯霉素，将其溶解在含有3mL 离子液体([BMIM]BF4)和四氢呋喃安培瓶中，[BMIM]BF4)和四氢呋喃的体积比为1:1；然后将1mmol功能单体2-乙烯基吡啶也溶解在上述含有3mL 离子液体([BMIM]BF4)和四氢呋喃安培瓶中，振荡30min，使模板和功能单体相互作用形成复合物，再向上述的溶液中加入5mmol交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）和引发剂偶氮二异丁腈（AIBN） 10mg，并且摩尔比为氯霉素: 2-乙烯基吡啶: 乙二醇二甲基丙烯酸酯=1:4:20，离子液体的体积用量与模板分子氯霉素的摩尔量之比为6mL/mmol；混合均匀后，分子印迹溶液经过超声脱气，超声10min，通入氮气10min除氧，最后抽真空将安培瓶密封，然后将安培瓶在真空下密封，60℃水浴反应24小时。

将生成的聚合物研磨过筛，筛分出粒径300-700 nm的聚合物分别用甲醇-乙酸(90：10 V/V)洗脱模板分子，直至用HPLC无法检测出模板分子氯霉素。对产物继续用乙腈做萃取剂，除去残留在聚合物中的甲醇和乙酸。最后，在60℃ 恒温真空干燥分子印迹聚合物，时间24小时以，除去残留的乙腈。其发明效果如图1所示。

实施例2：

首先称取0.25mmol模板分子氯霉素，将其溶解在含有3mL 离子液体([BMIM]BF4)和四氢呋喃安培瓶中，[BMIM]BF4)和四氢呋喃的体积比为2:1；然后将1mmol功能单体2-乙烯基吡啶也溶解在上述含有3mL 离子液体([BMIM]BF4)和四氢呋喃安培瓶中，振荡30min，使模板和功能单体相互作用形成复合物，再向上述的溶液中加入5mmol交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）和引发剂偶氮二异丁腈（AIBN） 10mg，并且摩尔比为氯霉素: 2-乙烯基吡啶: 乙二醇二甲基丙烯酸酯=1:4:20，离子液体的体积用量与模板分子氯霉素的摩尔量之比为12mL/mmol；混合均匀后，分子印迹溶液经过超声脱气，超声10min，通入氮气10min除氧，最后抽真空将安培瓶密封，然后将安培瓶在真空下密封，60℃水浴反应24小时。

将生成的聚合物研磨过筛，筛分出粒径300-400 nm的聚合物分别用甲醇-乙酸(90：10 V/V)洗脱模板分子，直至用HPLC无法检测出模板分子氯霉素。对产物继续用乙腈做萃取剂，除去残留在聚合物中的甲醇和乙酸。最后，在60℃ 恒温真空干燥分子印迹聚合物，时间24小时以，除去残留的乙腈。其发明效果如图2所示。