本发明属于生物制药
技术领域：
，具体涉及一种双抗原特异性T细胞及其产生方法及包含双抗原特异性T细胞的靶向三阴性乳腺癌细胞的药物制剂。
背景技术：
：T淋巴细胞是参与肿瘤细胞免疫治疗的主要效应细胞，T细胞的激活依靠“双信号”细致地调控。第一信号是T淋巴细胞表面的一种特异性受体TCR(Tcellrecepor)分子与肿瘤细胞表面主要组织相容性复合体(MHC)提呈的抗原肽的结合，即T细胞对抗原的识别；第二信号是协同刺激分子与T细胞表面的相应受体或配体相互作用介导的信号。CD28/B7是重要的正性共刺激分子，其主要作用是促进IL-2合成。如T细胞缺乏共刺激信号，会导致T细胞无能。三阴性乳腺癌(TripleNegativeBreastCancer，TNBC)是一种高度侵袭性的肿瘤，其细胞表面不表达雌激素受体(EstrogenReceptor，ER)，孕激素受体(ProgestroneReceptor，PR)和表皮生长因子受体(EpidermalGrowthFactorReceptor，EGFR)。由于缺乏有效的分子靶点，临床上缺乏针对TNBC的有效治疗手段，因此TNBC的总体生存率低于其它类型的乳腺癌患者，且更易发生淋巴结转移。间皮素(Mesothelin，简称Meso)是一种分子量为40kDa的细胞表面糖蛋白，高表达于多种恶性实体肿瘤组织中，已有研究表明Meso在TNBC细胞表面有较高的表达水平，但同时Meso在正常胸膜、心包和腹膜的间皮细胞中也有少量表达。另外，最新研究显示，在TNBC细胞表面还检测到高表达的低氧诱导因子-1α(hypoxiainduciblefactor-1α，HIF-1α)。因此，如何能够有效对TNBC进行识别与杀伤，并避免对正常细胞误杀是需要克服的问题。技术实现要素：本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种双抗原特异性T细胞及其制备方法，以解决当前不能有效对TNBC进行识别与杀伤，且容易造成对正常细胞误杀的技术问题。本发明实施例的另一目的在于提供一种靶向三阴性乳腺癌细胞的药物制剂，以解决现有生物治疗三阴性乳腺癌存在疗效不佳，以及对正常细胞造成损伤的技术问题。为了实现上述发明目的，作为本发明的一方面，提供了一种双抗原特异性T细胞。所述双抗原特异性T细胞包括间皮素抗原特异性T细胞受体基因和在HIF-1α抗体介导下特异性识别HIF-1α抗原的抗体Fc段特异性T细胞受体基因。相应地，本发明实施例提供了一种双抗原特异性T细胞的制备方法。所述制备方法包括如下步骤：将T细胞被第一慢病毒和第二慢病毒同时感染；所述第一慢病毒含有间皮素抗原特异性T细胞受体基因，所述第二慢病毒含有所述HIF-1α抗原特异性T细胞受体基因。作为本发明的另一方面，提供了一种靶向三阴性乳腺癌细胞的药物制剂。所述药物制剂包括本发明双抗原特异性T细胞或者由本发明制备方法制备的双抗原特异性T细胞，还包括HIF-1α抗体。与现有技术相比，本发明双抗原特异性T细胞由于含有间皮素抗原特异性T细胞受体基因和在HIF-1α抗体介导下特异性识别HIF-1α抗原的抗体Fc段特异性T细胞受体基因，因此，本发明双抗原特异性T细胞具有两个特异性结合域，可靶向Meso和HIF-1α抗体介导下特异性识别HIF-1α抗原的双特异性，保证了本发明实施例双抗原特异性T细胞对TNBC细胞的特异性识别与杀伤，同时避免了机体正常细胞的误杀损伤。本发明双抗原特异性T细胞制备方法通过含有间皮素抗原特异性T细胞受体基因的第一慢病毒和含有抗体Fc段特异性T细胞受体基因的第二慢病毒对T细胞感染，使得感染得到的转基因T细胞具有靶向Meso和抗体Fc段的两个特异性结合域，保证了本发明双抗原特异性T细胞对TNBC细胞的特异性识别与杀伤，同时避免了机体正常细胞的误杀损伤，而且本发明制备方法对T细胞感染率高。本发明靶向三阴性乳腺癌细胞的药物制剂由于含有本发明双抗原特异性T细胞和HIF-1α抗体，在HIF-1α抗体介导下，能够同时识别到表达在同一TNBC细胞表面的Meso和HIF-1α抗原，从而激活本发明双抗原特异性T细胞杀死肿瘤细胞，同时能够有效避免对正常细胞的误伤。另外，由于HIF-1α抗体能够介导本发明双抗原特异性T细胞对TNBC肿瘤细胞表面的HIF-1α抗原特异识别，因此，本发明药物制剂可通过调节HIF-1α抗体浓度来控制活化所含的双特异性TCR基因修饰T细胞的治疗剂量，进一步提高了药物制剂治疗三阴性乳腺癌的安全性。附图说明下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：图1为本发明实施例人工构建的Meso/scFv--CD8-CD3ζ基因结构图；图2为本发明实施例人工构建的CD16-CD28-TCRζ基因结构图；图3为本发明实施例入门克隆pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD3ζ质粒酶切产物的电泳条带图；图4为本发明实施例重组慢病毒表达质粒pLenti6.3/Meso/scFv-CD8-CD3ζ转化菌落PCR产物的电泳条带图；图5为本发明实施例入门克隆pENTRTM/D-TOPO-CD16-CD28-TCRζ质粒酶切产物的电泳条带图；图6为本发明实施例重组慢病毒表达质粒pLenti6.3/CD16-CD28-TCRζ转化菌落PCR产物的电泳条带图；图7为本发明实施例T细胞体外杀伤三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的流式检测图；其中，WT-T细胞：阴性对照组T细胞；M/HBi-TCR-T细胞：单纯M/HBi-TCR-T细胞；Hif1α-M/HBi-TCR-T细胞：1ug/mlHif1α抗体共孵育的M/HBi-TCR-T细胞；图8为本发明实施例荷瘤裸鼠腋下移植瘤的生长图片；其中，图(1)为阴性对照组；图(2)为单纯化疗组；图(3)为单纯M/HBi-TCR-T细胞治疗组；图(4)为M/HBi-TCR-T细胞联合Hif1α抗体治疗组；图9为本发明实施例M/HBi-TCR-T细胞杀伤示意图。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。由于三阴性乳腺癌(TripleNegativeBreastCancer，TNBC)细胞表面含有有较高表达水平的间皮素(Mesothelin，简称Meso)和低氧诱导因子-1α(hypoxiainduciblefactor-1α，HIF-1α)。因此，本发明实施例基于TNBC细胞该特性，构建了一种能够同时靶向Meso和HIF-1α抗原的双抗原特异性T细胞及其制备方法和含有本发明实施例双抗原特异性T细胞的靶向三阴性乳腺癌细胞的药物制剂。一方面，本发明实施例双抗原特异性T细胞包括间皮素抗原特异性T细胞受体基因和在HIF-1α抗体介导下特异性识别HIF-1α抗原的抗体Fc段特异性T细胞受体基因。因此，本发明实施例双抗原特异性T细胞可以表示为Meso/HIF-1αBispecificTCR-T(简写为M/HBi-TCR-T)。由于本发明实施例双抗原特异性T细胞由于含有间皮素抗原特异性T细胞受体基因和抗体Fc段特异性T细胞受体基因，这样，M/HBi-TCR-T细胞具有两个特异性结合域，其中第一结合域可靶向Meso抗原，激发T细胞活化的第一信号，第二结合域则靶向肿瘤特异性抗体的Fc片段，在HIF-1α抗体介导下靶向肿瘤HIF-1α抗原，激发T细胞活化的第二信号，单独识别其中一种肿瘤抗原并不足以激活T细胞，只有识别到表达在同一肿瘤细胞表面的Meso和HIF-1α抗原后才能产生足够强大的信号激活T细胞杀死肿瘤细胞，同时避免了机体正常细胞的误杀损伤。其中，在一实施例中，所述间皮素抗原特异性T细胞受体基因设于Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段中。在具体实施例中，所述间皮素抗原特异性T细胞受体基因是由含有Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段的病毒感染至双抗原特异性T细胞中，其中，Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段可由下文Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段构建方法获得。在另一实施例中，所述抗体Fc段特异性T细胞受体基因设于CD16–CD28-TCRζ基因片段中。在具体实施例中，所述抗体Fc段特异性T细胞受体基因是由含有CD16–CD28-TCRζ基因片段的病毒感染至双抗原特异性T细胞中。其中，CD16–CD28-TCRζ基因片段可由下文CD16–CD28-TCRζ基因片段构建方法获得。由于抗体Fc段特异性T细胞受体基因含有CD16基因，因此，使得本发明实施例双抗原特异性T细胞能够靶向肿瘤特异性抗体的Fc片段。由上文所述可知，本发明实施例双抗原特异性T细胞具有可靶向Meso和HIF-1α抗原的两个特异性结合域，保证了本发明实施例双抗原特异性T细胞对TNBC细胞的特异性识别与杀伤，同时避免了机体正常细胞的误杀损伤。另一方面，在上文所述的本发明实施例双抗原特异性T细胞的基础上，本发明实施例还提供了本发明实施例双抗原特异性T细胞一种制备方法。本发明实施例制备方法包括以下步骤：将T细胞被第一慢病毒和第二慢病毒同时感染。其中，所述第一慢病毒含有上文所述的间皮素抗原特异性T细胞受体基因。在一实施例中，所述第一慢病毒按照如下方法制备获得：S11：将Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段与入门载体混合，以使所述Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段嵌入所述入门载体，而获得带有Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段的入门载体；S12：将所述带有Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段的入门载体与慢病毒质粒混合重组，以建立间皮素抗原特异性T细胞受体表达质粒；S13：将所述间皮素抗原特异性T细胞受体表达质粒与病毒包装质粒、共转染293T细胞，获得第一慢病毒。步骤S11中，Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段获得方法包括如下步骤：S111：获取Meso抗原免疫总cDNA；S112：将所述Meso抗原免疫总cDNA与Meso抗体重链可变区VH引物和轻链可变区VL引物进行PCR，获得MesoVH和MesoVL基因片段；S113：将所述MesoVH与MesoVL基因片段采用连接肽连接，获得Meso抗体scFv基因片段；S114：将所述Meso抗体scFv基因片段与pcDNA载体连接，获得pcDNA-Meso/scFv质粒；S115：将人CD8分子基因片段和CD3ζ链胞内段克隆进所述pcDNA-Meso/scFv质粒，获得pcDNA3-Meso/scFv-CD8-CD3ζ质粒，酶切后获得Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段。其中，步骤S112中的Meso抗体重链可变区VH引物和轻链可变区VL引物可以根据重链可变区VH和轻链可变区VL序列按照引物设计原则进行设计，在具体实施例中，重链可变区VH的引物为SEQIDNO1和SEQIDNO2，轻链可变区VL的引物为SEQIDNO3和SEQIDNO4：SEQIDNO：1：5'-AGGT(G/C)(A/C)A(A/G)CTGCAG(G/C)AGTC(A/T)GG-3'SEQIDNO：2：5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC-3'SEQIDNO：3：5'-GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA-3'SEQIDNO：4：5'-CCCTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC-3'。步骤S113中的连接肽可以是采用的连接肽，针对该重链可变区VH和轻链可变区VL序列特性，在本实施例中，选用连接肽(Gly4Ser)3，其碱基序列如下SEQIDNO：5：5'-GGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCT-3'步骤S114中的pcDNA载体可以是pcDNA载体系列中常用的载体，在具体实施例中，pcDNA载体为pcDNA3。步骤S115中的人CD8分子基因片段为471-737bpcDNA序列。CD3ζ链胞内段为228-563bpcDNA序列，且CD8分子基因片段和CD3ζ链胞内段可以直接在Pubmed基因库进行检索获得。另外，在步骤S11中，作为具体实施例，入门载体可以但不仅仅为pENTR/D-TOPO。上述步骤S12中，慢病毒质粒可以是常用的慢病毒载体，如但不仅仅选用pLenti6.3/V5-DEST。上述步骤S13中，病毒包装质粒可以是常用的病毒包装质粒，如但不仅仅选用ViraPowerTM包装质粒。上文双抗原特异性T细胞制备方法中的所述第二慢病毒含有上文所述的抗体Fc段特异性T细胞受体基因，具体是在HIF-1α抗体介导下特异性识别HIF-1α抗原的抗体Fc段特异性T细胞受体基因。在一实施例中，所述第二慢病毒按照如下方法制备获得：S21：将CD16–CD28-TCRζ基因片段与入门载体混合，以使所述CD16–CD28-TCRζ基因片段嵌入所述入门载体，而获得带有CD16–CD28-TCRζ基因片段的入门载体；以及S22：将所述带有CD16–CD28-TCRζ基因片段的入门载体与慢病毒质粒混合重组，以建立CD16–CD28-TCRζ慢病毒表达质粒；S23：将所述CD16–CD28-TCRζ慢病毒表达质粒与病毒包装质粒、共转染293T细胞，获得第二慢病毒。步骤S21中，CD16–CD28-TCRζ基因片段获得方法包括如下步骤：S211：将人CD16分子基因片段与pcDNA载体连接，获得pcDNA-CD16质粒；S212：将CD28分子胞内结构域克隆进所述pcDNA-CD16质粒，获得pcDNA-CD16-CD28质粒；S213：将CD28核苷酸336-660bp区域和TCRζ胞内结构域PCR合并成基因片段后克隆进所述pcDNA-CD16-CD28质粒，酶切后获得CD16-CD28-TCRζ基因片段。步骤S211中的人CD16分子基因片段可以为843bpcDNA序列。CD3ζ链胞内段为228-563bpcDNA序列，且人CD16分子基因可以直接在Pubmed基因库进行检索获得。另外，步骤S211中的pcDNA载体可以是pcDNA载体系列中常用的载体，在具体实施例中，pcDNA载体为pcDNA3。另外，在步骤S21中，作为具体实施例，入门载体可以但不仅仅为pENTR/D-TOPO。上述步骤S22中，慢病毒质粒可以是常用的慢病毒载体，如但不仅仅选用pLenti6.3/V5-DEST。上述步骤S23中，病毒包装质粒可以是常用的病毒包装质粒，如但不仅仅选用ViraPowerTM包装质粒。另外，上述双抗原特异性T细胞制备方法中的第一慢病毒和第二慢病毒同时感染T细胞可以按照正常的慢病毒感染方法进行感染。因此，本发明实施例双抗原特异性T细胞制备方法通过含有间皮素抗原特异性T细胞受体基因的第一慢病毒和含有抗体Fc段特异性T细胞受体基因的第二慢病毒对T细胞感染，使得感染得到的转基因T细胞具有靶向Meso和HIF-1α抗体介导下特异性识别HIF-1α抗原的两个特异性结合域，保证了本发明实施例双抗原特异性T细胞对TNBC细胞的特异性识别与杀伤，同时避免了机体正常细胞的误杀损伤，而且本发明制备方法对T细胞感染率高。又一方面，基于上文本发明实施例双抗原特异性T细胞及其制备方法，本发明实施例还提供了一种靶向三阴性乳腺癌细胞的药物制剂。所述药物制剂包括双抗原特异性T细胞和HIF-1α抗体，其中，所述双抗原特异性T细胞为上文所述的本发明实施例双抗原特异性T细胞或由上文本发明制备方法制备的双抗原特异性T细胞。这样，该药物制剂由于含有本发明双抗原特异性T细胞和HIF-1α抗体，由于如上文所述的，本发明实施例双抗原特异性T细胞具有可靶向Meso和HIF-1α抗原的两个双特异性结合域，因此，在HIF-1α抗体介导下，能够同时识别到表达在同一TNBC细胞表面的Meso和HIF-1α抗原，从而激活本发明双抗原特异性T细胞杀死肿瘤细胞，同时能够有效避免对正常细胞的误伤。另外，在本发明实施例靶向三阴性乳腺癌细胞的药物制剂中，由于HIF-1α抗体能够介导本发明实施例双抗原特异性T细胞对TNBC肿瘤细胞表面的HIF-1α抗原特异识别，因此，本发明实施例药物制剂可通过调节HIF-1α抗体浓度来控制活化所含的双特异性TCR基因修饰T细胞的治疗剂量，进一步提高了药物制剂治疗三阴性乳腺癌的安全性，如当停止抗体给药可以终止本发明实施例双抗原特异性T细胞的功能，不必清除本发明实施例双抗原特异性T细胞，确保了治疗的有效性和减少毒副作用。如在一实施例中，所述双抗原特异性T细胞与HIF-1α抗体含量比为(104-106个细胞)：(0.5-5μg)，优选的为105个细胞：1μg。具体地，本发明实施例靶向三阴性乳腺癌细胞的药物制剂中双抗原特异性T细胞与HIF-1α抗体杀伤TNBC肿瘤的原理如附图9所示。其中，附图9(A)中，M/HBi-TCR-T细胞识别正常细胞表面Meso抗原/MHCI复合物，由于正常细胞表面没有HIF-1α抗原，因此，无法激活第二信号，对正常细胞不杀伤；图9(B)中，M/HBi-TCR-T细胞在Hif1α抗体介导下识别正常细胞表面Hif1α抗原，由于正常细胞表面没有间皮素，因此，无法激活第一信号，对正常细胞不杀伤；图9(C)中，M/HBi-TCR-T细胞识别三阴性乳腺癌细胞表面的Meso抗原/MHCI复合物，但由于Hif1α抗体缺失，不能识别三阴性乳腺癌细胞表面的Hif1α抗原，对三阴性乳腺癌细胞不杀伤；图9(D)中，M/HBi-TCR-T细胞识别三阴性乳腺癌细胞表面的Meso抗原/MHCI复合物，在Hif1α抗体介导下通过CD16分子识别三阴性乳腺癌细胞表面的Hif1α抗原，从而激活并杀伤三阴性乳腺癌细胞。其次，上述药物制剂包括的双抗原特异性T细胞和HIF-1α抗体的含量或者给药剂量应该是有效剂量的，具体地，该有效剂量是指治疗有效量，是指足以对个体显示益处或临床意义的本发明的化合物的量。本领域技术人员将会理解，给药的实际量或剂量以及给药时程将取决于被治疗的疾病的性质和严重性、被治疗的受试者的年龄和一般状况以及给药方式等。理所当然的是，在上述药用制剂中还可以包含药学上可接受的载体。在具体实施例中，该药学上可接受的载体是指本领域技术人员已知的适合于特定的给药模式的任何辅料。下面通过具体实施例对本发明做进一步详细说明。实验步骤1.表达Meso抗原特异性scFv-CD8-CD3ζ融合受体的慢病毒1.1获取Meso抗原免疫小鼠总cDNA利用Meso抗原对BALB/C小鼠进行免疫，效价符合要求(1:100000以上)时，处死小鼠，取脾脏，用Trizol法提取小鼠脾脏总RNA。采用iScriptcDNASynthesisKit合成总cDNA，反应体系如下表1：表1试剂体积5×iScriptreactionmix4μliScriptreversetranscriptase1μlNuclease-freewater5μl总RNA10μl总体积20μl反应条件：25℃5min→42℃30min→85℃5min→4℃hold。1.2Meso抗体重链可变区VH及轻链可变区VL基因的获取Meso抗体重链可变区VH及轻链可变区VL引物序列如下表2所示：表2引物名称引物序列SEQIDNOVH-F5'-AGGT(G/C)(A/C)A(A/G)CTGCAG(G/C)AGTC(A/T)GG-3'1VH-R5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC-3'2VL-F5'-GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA-3'3VL-R5'-CCCTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC-3'4Meso抗体重链可变区VH及轻链可变区VL的PCR反应体系如下表3：表3试剂体积TaqDNA聚合酶0.25μl10×PCRBuffer5μldNTPs(2.5mM)4μlMeso抗原免疫小鼠总cDNA1μlVH-F(20μM)1μlVH-R(20μM)1μlddH2O补充至50μl该PCR反应条件如下：94℃预变性5min，94℃45s，60℃1min，72℃1min，共35个循环，72℃延伸5min。1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收Meso抗体重链可变区VH及轻链可变区VL基因PCR产物。1.3Meso抗体scFv片段及质粒的获取通过多基因片段重叠延伸PCR(OverlapExtensionPCR，OE-PCR)将1.2中得到的MesoVH和MesoVL片段用连接肽(Gly4Ser)3(碱基序列：5'-GGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCT-3')(SEQIDNO：5)连接起来，得到Meso抗体scFv片段，并引入酶切位点HinIII/BamHI。OE-PCR反应条件如下：(1)步骤1：95℃预变性1min，94℃1min，60℃1min，72℃1min，共7个循环，72℃延伸10min；(2)步骤2：95℃预变性5min，94℃45s，62℃1min，72℃1min，共35个循环，72℃延伸5min。1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收Meso抗体scFv片段，利用T4DNA连接酶将Meso抗体scFv片段与pcDNA3载体连接，获得pcDNA3-Meso/scFv质粒。1.4Meso抗原特异性scFv-CD8-CD3ζ基因片段的构建在Pubmed基因库进行检索，获取人CD8分子片段(471-737bp)和CD3ζ链胞内段(228-563bp)cDNA序列，设计引物，同时添加限制性酶切位点。引物序列如下表4所示：表4以人T细胞总cDNA为模板，分别合成人CD8分子片段和CD3ζ链胞内段，1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，分别回收基因片段。利用引物CD8-F、CD3ζ-R合成上述两段PCR产物，BamHI/XhoI酶切后克隆进pcDNA3-Meso/scFv质粒，获得pcDNA3-Meso/scFv-CD8-CD3ζ质粒，HinIII/XhoI酶切后获得Meso/scFv--CD8-CD3ζ基因片段，基因结构图见图1所示。1.5Meso/scFv-CD8-CD3ζ入门克隆的构建1.5.1Meso/scFv-CD8-CD3ζ入门克隆TOPO连接反应体系如下表5所示：TOPO克隆反应条件：将上述反应体系轻轻摇匀后，在室温(21-23℃)下孵育5min。孵育结束后将反应体系置于冰上以进一步转化感受态细胞，进行扩大培养并提取pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD3ζ质粒。表5Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段0.5μl盐溶液1μlddH2O3.5μlpENTRTM/D-TOPOvector1μl总体积6μl1.5.2入门克隆pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD3ζ的酶切鉴定1.5.2.1酶切体系(NotI/AscI双酶切体系)如表6所示：表6提纯的入门克隆pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD3ζ3.0μlNotI0.5μlAscI0.5μl100×BSA0.2μl10×Buffer2.0μlddH2O15μl总体积21.2μl1.5.2.2酶切条件：37℃水浴锅中酶解2h；1.5.2.3取2μl酶解产物，用1.2％琼脂糖凝胶进行电泳检测。分析电泳条带以判断入门克隆是否正确。若入门克隆pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD3ζ正确，NotI/AscI双酶切得到两条分别为1.6kb和2.5kb的片段。1.6pLenti6.3/Meso/scFv-CD8-CD3ζ慢病毒表达质粒的构建1.6.1LR反应LR反应是入门克隆pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD3ζ和目的载体pLenti6.3/V5-DESTvector发生的重组反应，重组之后得到慢病毒表达质粒pLenti6.3/V5/Meso/scFv--CD8-CD3ζ。LR反应体系如下表7所示：冰上解冻LRClonaseTMIIPlusEnzymeMix，吸取2μl加至上述LR反应体系中，轻柔混匀后，25℃放置1h。加入1μl蛋白酶K至上述反应体系，37℃孵育10min。表71.6.2LR反应产物的转化步骤1.6.2.1在冰上将一管E.coli感受态细胞(Invitrogen,Cat.No.C7373-03)解冻；1.6.2.2加入2-3μlLR反应产物至感受态细胞悬液中，轻柔混匀(切勿用移液枪吹打)。冰上孵育30min，42℃水浴中热击处理30s，将反应管转移至冰上继续孵育2min；1.6.2.3加入225μl室温下预温的S.O.C.培养基；1.6.2.4将反应管盖紧后置于37℃水平摇床中225rpm转速下孵育1h；1.6.2.5取出100μl转化产物均匀涂布到预热的LB平板(含氨苄青霉素)上，37℃培养箱中孵育过夜。1.6.3阳性克隆的筛选与扩增的步骤1.6.3.1用枪头分别少量蘸取3个克隆后，将枪头置于10μl无菌水中，反复吹打；1.6.3.2吸取1μl菌液用于PCR，其反应体系如下表8：表8菌液1μlTCR正向引物(20μM)1μlV5反向引物(20μM)1μlBio-radsupermix6.25μlddH2O15.75μl总体积25μlPCR反应条件如下：1.6.3.3三个克隆的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳反应，若在1.6kb处得到清晰的单一条带，则将鉴定出的阳性克隆挑到含氨苄青霉素的LB培养液中进行扩大培养；1.6.3.4用质粒DNA纯化试剂盒(Promega，Cat.No.A7500)从上述过夜培养的菌液中分离纯化质粒DNA即为慢病毒表达质粒pLenti6.3/Meso/scFv--CD8-CD3ζ，同时保存菌种；1.7pLenti6.3/Meso/scFv-CD8-CD3ζ慢病毒的制备1.7.1Day1：取5×106个293FT细胞(Invitrogen,Cat.No.R700-07)，离心后弃上清，用10ml37℃预热的完全培养基(D-MEM+10％FBS+2mML-谷氨酰胺+0.1mM非必须氨基酸+1mM丙酮酸钠+1％P/S)重悬，接种于10cm培养皿中，37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜；1.7.2Day2：弃去培养皿中的培养液，加入5ml含10％FBS的I培养液(Invitrogen,Cat.No.31985-062)；1.7.32000复合物的制备：1.7.3.1将1.5ml无血清的I培养液加入5ml离心管中，加入9μgViraPowerTM包装质粒混合物和3μg慢病毒表达质粒pLenti6.3/TO/V5/Meso/scFv--CD8-CD3ζ，轻柔混合；1.7.3.2将1.5ml无血清的I培养液加入另一个5ml离心管中，加入36μl2000，轻柔混合后在室温下孵育5min；1.7.3.3将1.7.3.1和1.7.3.2两步得到的溶液转移到一个离心管中，轻柔混合均匀；1.7.3.4室温下孵育20min，得到2000复合物。1.7.4将得到的2000复合物逐滴缓慢加入到培养皿中，并轻轻地来回晃动培养皿。37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜；1.7.5Day3：取出培养皿，弃去培养液，加入10mlDMEM完全培养基。37℃，5％CO2培养箱中孵育48-72h；1.7.6Day5或Day6：将培养皿中的培养液转移到15ml离心管中，在4℃条件下2000g离心15min；1.7.7吸取上清液，收集pLenti6.3/Meso/scFv--CD8-CD3ζ慢病毒，分装入1ml冻存管中，置于-80℃长期保存。2.表达CD16-CD28–TCRζ融合受体的慢病毒2.1CD16–CD28-TCRζ基因片段的构建在GenBank数据库中检索人CD16(FcfragmentofIgGlowaffinityIIIareceptor，序列，设计如表9所示的引物，以人PBMC细胞总cDNA为模板，PCR获取CD16分子基因片段(843bp)。1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收CD16分子基因片段，利用T4DNA连接酶将CD16分子基因片段与pcDNA3载体连接，获得pcDNA3-CD16质粒。表9引物名称引物序列SEQIDNOCD16-F5'-AGAGAATTCICTTTGGTGACTTGTCCACTC-3'(EcoRI)10CD16-R5'-AGAACATGCGCTCTTATTACTCCCATGGGA-3'(NspI)11以人T细胞总cDNA为模板，以如下表10中的引物A和引物B合成CD28分子胞内结构域，NspI/XhoI酶切后克隆进pcDNA3-CD16质粒，获得pcDNA3-CD16-CD28(IC)质粒。以人T细胞总cDNA为模板，以如下表10中的引物C、引物D合成CD28核苷酸336–660区域，以如下表10中的引物E、引物F合成TCRζ胞内结构域。利用如下表10中的引物C、F合成上述两段PCR合成片段，XhoI/BamHI酶切后克隆进pcDNA3-CD16-CD28(IC)质粒，获得pcDNA3-CD16-CD28-TCRζ质粒。CD16–CD28-TCRζ融合受体质粒构建所用到的引物序列如下表10所示：表10将上述获得的pcDNA3-CD16-CD28-TCRζ质粒进行EcoRI//BamHI酶切后获得CD16-CD28-TCRζ基因片段，基因结构图见图2所示。2.2CD16-CD28-TCRζ入门克隆的构建2.2.1CD16-CD28-TCRζ入门克隆TOPO连接反应体系如表11下：表11CD16-CD28-TCRζ基因片段0.5μl盐溶液1μlddH2O3.5μlpENTRTM/D-TOPOvector1μl总体积6μlTOPO克隆反应条件：将上述反应体系轻轻摇匀后，在室温(21-23℃)下孵育5min。孵育结束后将反应体系置于冰上以进一步转化感受态细胞，进行扩大培养并提取pENTRTM/D-TOPO-CD16-CD28-TCRζ质粒；2.2.2入门克隆pENTRTM/D-TOPO-CD16-CD28-TCRζ的酶切鉴定2.2.2.1酶切体系(NotI/AscI双酶切体系)如表12所示：表12提纯的入门克隆pENTRTM/D-TOPO-CD16-CD28-TCRζ3.0μlNotI0.5μlAscI0.5μl100×BSA0.2μl10×Buffer2.0μlddH2O15μl总体积21.2μl2.2.2.2酶切条件：37℃水浴锅中酶解2h；2.2.2.3取2μl酶解产物，用1.2％琼脂糖凝胶进行电泳检测。分析电泳条带以判断入门克隆是否正确。若入门克隆pENTRTM/D-TOPOMeso/-CD16-CD28-TCRζ正确，NotI/AscI双酶切得到两条分别为1.4kb和2.5kb的片段。2.3pLenti6.3/CD16-CD28-TCRζ慢病毒表达质粒的构建具体实验步骤参考步骤1.6，转化后的细菌进行PCR，产物进行琼脂糖凝胶电泳反应，若在1.4kb处得到清晰的单一条带，则将鉴定出的阳性克隆挑到含氨苄青霉素的LB培养液中进行扩大培养。用质粒DNA纯化试剂盒(Promega，Cat.No.A7500)从上述过夜培养的菌液中分离纯化质粒DNA即为慢病毒表达质粒pLenti6.3/CD16-CD28-TCRζ，同时保存菌种。2.3pLenti6.3/CD16-CD28-TCRζ慢病毒的制备：具体实验步骤参考步骤1.7。3.Meso/HIF-1α双特异性TCR-T(M/HBi-TCR-T)细胞的制备及扩增3.1分离基因分型HLA-A2+健康志愿者PBMC细胞3.1.1抽取HLA-A2+的健康志愿者外周血25ml，肝素抗凝，室温离心(700g，20min)；吸取上层血浆，置于水浴锅中56℃，30min；然后4℃静置15min后，离心(900g，30min)，取自体血浆4℃保存备用；3.1.2取上述700g，20min离心后下部细胞成分，加D-PBS至50ml，混匀，缓慢加到装有20ml人淋巴细胞分离液的50ml离心管中，室温离心(800g，15min)；3.1.3吸取白膜层细胞，加入到装有5mlRPMI1640的50ml离心管中；3.1.4RPMI1640洗涤两次(600g，10min离心)，收集细胞即为PBMC细胞；3.2M/HBi-TCR-T细胞的制备3.2.1用含50ng/mlCD3单抗、1000U/mlIL-2和0.5％自体血浆的Alys-505培养液调整PBMC细胞密度为1×106/ml，转入六孔板中，2ml/孔，同时每孔添加1000U/ml的IFN-γ，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养箱中培养；3.2.2每3天调整细胞密度为1×106/ml，添加含1000U/mlIL-2和0.5％自体血浆的Alys-505培养液；3.2.3第7天，将T细胞分成两组，一组用于转染Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因和CD16-CD28-TCRζ基因(M/HBi-TCR-T组)，另一组按正常T淋巴细胞培养步骤进行培养(WT-T组)，两组细胞均按105/孔的密度转移至24孔板中，100μl/孔；3.2.4各解冻一管pLenti6.3/Meso/scFv-CD8-CD3ζ慢病毒和pLenti6.3/CD16-CD28-TCRζ慢病毒溶液，各吸取20μl慢病毒溶液加至60μlAlys-505完全培养基中，用移液管将稀释后的慢病毒溶液加至M/HBi-TCR-T组的24孔板中，轻轻吹打混匀。WT-T组加入100μlAlys-505完全培养基；3.2.5两组分别加入终浓度为6μg/ml的Polybrene，来回轻轻晃动混合均匀后，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育24h；3.2.6第8天，两组细胞分别取出离心，弃掉含慢病毒的上清液，分别用200μlAlys-505培养液重悬，加入24孔板中。根据细胞生长状态进行补液；3.2.7第14天，收获成熟的M/HBi-TCR-T组细胞和对照组WT-T细胞用于后续分析。4.M/HBi-TCR-T细胞体外抗肿瘤活性检测4.1以M/HBi-TCR-T细胞、1ug/mlHif1α抗体共孵育的M/HBi-TCR-T细胞(Hif1α-M/HBi-TCR-T细胞)、WT-T细胞作为效应细胞，其中T细胞密度均为105/ml，CFSE标记的三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞作为靶细胞，按照20:1的效靶比混合效应细胞和靶细胞，轻轻混匀，置于5％CO2，37℃培养箱中孵育；4.224h后，加入1μg/mlPI染液，混匀，室温避光孵育15min后，利用流式细胞仪检测CFSE+PI+细胞(死亡的MDA-MB-231细胞)的百分率。5.M/HBi-TCR-T细胞动物体内抗肿瘤活性检测取对数生长期的人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，将含1×107个癌细胞的悬液0.1ml于裸鼠腋下注射。实验分组及治疗情况见表13所示，每日观察各组荷瘤裸鼠的饮食、活动等方面的变化，隔日测量裸鼠体重，观察体重变化情况；隔2天测量肿瘤的最大纵径(a)及最大横径(b)，观察肿瘤生长的情况，按照公式计算：瘤体积＝1/2×a×b2。第(4)组治疗结束后第13天计算各组裸鼠的抑瘤率，抑瘤率＝(1-治疗组肿瘤平均体积/阴性对照组肿瘤平均体积)×100％。表13实验分组及治疗情况*FAC化疗方案：氟尿嘧啶500mg/M2；阿霉素50mg/M2；环磷酰胺500mg/M2，第一天给药，21天一个疗程。6.实验结果6.1入门克隆pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD3ζ的酶切鉴定入门克隆pENTRTM/D-TOPO-Meso/scFv-CD8-CD3ζ质粒经过NotI/AscI双酶切后得到的产物经琼脂糖凝胶电泳检测，分别在大约1.6kb和2.5kb处有清晰条带如图3，与预期片段数和片段大小一致。证明Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因正确插入到载体中。6.3重组慢病毒表达质粒pLenti6.3/Meso/scFv-CD8-CD3ζ转化菌落PCR产物的电泳结果随机挑取LB平板上的三个克隆，用设计的TCR正向引物和V5反向引物进行PCR扩增，PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，在1.6kb处出现清晰的条带，如图4所示，说明Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因成功插入到pLenti6.3/TO/V5-DEST表达载体中。6.4入门克隆pENTRTM/D-TOPO-CD16-CD28-TCRζ的酶切鉴定入门克隆pENTRTM/D-TOPO-CD16-CD28-TCRζ质粒经过NotI/AscI双酶切后得到的产物经琼脂糖凝胶电泳检测，分别在大约1.4kb和2.5kb处有清晰条带，如图5所示，与预期片段数和片段大小一致。证明CD16-CD28-TCRζ基因正确插入到载体中。6.5重组慢病毒表达质粒pLenti6.3/CD16-CD28-TCRζ转化菌落PCR产物的电泳结果随机挑取LB平板上的三个克隆，用设计的TCR正向引物和V5反向引物进行PCR扩增，PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，在1.4kb处出现清晰的条带，如图6所示，说明CD16-CD28-TCRζ基因成功插入到pLenti6.3/TO/V5-DEST表达载体中。6.6T细胞体外杀伤三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的流式检测结果M/HBi-TCR-T细胞、Hif1α-M/HBi-TCR-T细胞和WT-T细胞作为效应细胞，CFSE标记的三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞作为靶细胞，流式细胞术检测T细胞对MDA-MB-231细胞的杀伤效率，实验结果如图7所示。由图7可知，WT-T细胞对MDA-MB-231细胞的杀伤率约为22.15％，单纯M/HBi-TCR-T细胞对MDA-MB-231细胞的杀伤率约为25.71％，而Hif1α-M/HBi-TCR-T细胞对MDA-MB-231细胞的杀伤率高达70.83％，远远高于对照组WT-T细胞和单纯M/HBi-TCR-T细胞的杀伤率。体外实验结果说明本发明实施例提供的M/HBi-TCR-T细胞可在Hif1α抗体的控制下实现对三阴性乳腺癌细胞的高特异性、高效的杀伤作用。6.7M/HBi-TCR-T细胞体内抑制三阴性乳腺癌的实验结果治疗结束时120只动物全部存活。观察发现，阴性对照组裸鼠活动减少，反应迟钝，体重随着肿瘤的生长略有下降；单纯化疗组动物用药后虽肿瘤生长得到较好控制但消瘦严重，进食和活动明显减少；单纯M/HBi-TCR-T细胞治疗组肿瘤控制不及单纯化疗组理想，但裸鼠生活状态良好，体重未见明显下降；M/HBi-TCR-T细胞联合Hif1α抗体治疗组裸鼠觅食、饮水、活动等状况良好，体重也未见明显下降，且肿瘤生长得到较好控制，抑瘤率达到67.2％。体重情况和肿瘤抑制率统计结果见表14。表14各组裸鼠体重、肿瘤体积及抑瘤率的比较治疗结束后第13天，各组裸鼠腋下移植瘤的生长情况见图8，荷瘤裸鼠体内实验结果说明：本发明实施例提供的M/HBi-TCR-T细胞与Hif1α抗体联用可降低毒副作用，同时有效抑制肿瘤的生长。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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