一种荧光素酶报告基因系统检测转录因子表达活性的方法与流程

本发明属于分子生物学与细胞生物技术领域，具体涉及一种荧光素酶报告基因系统检测转录因子表达活性的方法。

背景技术：

在同一条核酸链上起调控基因表达作用的核酸序列称为顺式作用元件，包括启动子、增强子、衰减子等；转录因子也被称为反式作用因子，是一种特异性作用于启动子区域顺式作用元件从而能够对不同核酸链上的基因表达起调控作用的蛋白质分子。转录因子要发挥作用，必须具有一定的活性，这依赖于转录因子的数量及其与顺式作用元件结合的亲和力。可见，检测转录因子的活性，对于阐明某个基因的表达调控的规律，具有重要意义，因而被广泛应用于生物学和医学研究中。

特别是，真核生物基因的表达调控是当前分子生物学领域最前沿的研究方向之一，而转录水平的调控是基因表达过程中最为重要的步骤。由于蛋白质与蛋白质，蛋白质与DNA之间的相互作用，以及一些复杂大分子复合物的形成，导致真核生物转录水平的调控更为复杂；并且，转录因子及其表达调控的检测是研究其功能的重要前提基础，高效、特异、灵敏、简便的检测方法对于研究真核生物基因表达具有重要的作用。

目前，用于检测转录因子活性的最为常用方法有荧光定量PCR检测，该检测方法将转录因子表达载体转染到真核细胞内，并通过RT-PCR方法检测转录因子的表达水平，或通过蛋白表达水平间接反映转录活性；其中，RT-PCR检测方法需要将转录因子转染真核细胞，通过提取细胞中总RNA，进行PCR检测；然而，RNA对温度敏感且易降解，检测时需要设计多对引物进行目的RNA扩增，同时选取合适的内参及正负对照，上述这些缺陷导致检测的结果不能真实反映转录因子的表达活性，同时可重复性差，检测过程耗时较长。

因此，现有技术中也提供了提取细胞中总的蛋白质，并通过免疫印迹法(Western blotting)检测特定蛋白质的表达量，从而从侧面反应转录因子表达量；然而，该方法的操作更加繁琐，并且，由于蛋白提取过程中不可避免的损失以及降解，所测得的结果并不能真实反映真核细胞中转录因子的转录表达量，此外，整个实验的操作过程不可控因素比较多，因此相较于流行的RT-PCR检测方法而言，更加不适合于检测转录因子的表达活性。

此外，中国专利CN1637417A另外提供了一种转录因子活性检测方法，该方法是基于ELISA检测方法的改进，其特别之处是采用一种新的双链寡核苷酸探针构建，以克服ELISA检测方法双链寡核苷酸探针的设计构建所带来的不足。然而，该新型ELISA检测方法仍然存在操作繁琐且耗时较长的技术问题。

借助于荧光素酶报告基因系统实施的荧光素酶检测(luciferase assay)目前已被广泛应用于真核基因表达和细胞生理学研究，其应用包括受体活性、细胞内信号转导、mRNA加工和蛋白质折叠。建立荧光素酶报告基因检测系统简单、方便，并且荧光素酶持久稳定，因而可被用于检测转录因子与其启动子中的特异顺式作用元件结合的研究。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的上述问题，即为了提供一种操作简单、耗时短、高通量、可重复性高且准确度高的转录因子表达活性的检测方法，发明人拟充分利用荧光素酶检测，即借助于荧光素酶报告基因系统，提供一种新的检测转录因子表达活性的方法。

具体地，本发明记载的技术方案提供了一种荧光素酶报告基因系统检测转录因子表达活性的方法，包括以下步骤：

步骤(1)：根据待检测表达活性的转录因子的蛋白质组成，确定能与所述转录因子结合的靶基因启动子序列，将筛选到的靶基因启动子的特定片段插入荧光素酶报告基因载体，并且，插入后的所述靶基因启动子的特定片段位于荧光素酶Luc的表达序列的上游，从而制得包含靶基因启动子的荧光素酶报告基因载体；

步骤(2)：进行目标细胞的培养与铺板，得到待转染细胞；

步骤(3)：配制脂质体、所述包含靶基因启动子的荧光素酶报告基因载体和转录因子表达质粒的混合物，使用该混合物转染步骤(2)所制得的待转染细胞，获得被转染的细胞；

步骤(4)：将细胞裂解缓冲液加至所述被转染的细胞，进行裂解，收集裂解液，接着，离心所收集的裂解液，取上清液，加入至荧光素酶活性检测缓冲液中进行荧光素酶表达强度检测，并计算出荧光素酶的表达量，从而检测出所述转录因子的表达活性。

其中，所述裂解指的是细胞裂解缓冲液A对细胞膜的裂解。

在上述方法的步骤(1)中，可以运用已知的NCBI数据库以及TargetScan生物学软件等进行预测与确定能与所述转录因子结合的靶基因启动子序列。

优选地，在上述荧光素酶报告基因系统检测转录因子表达活性的方法中，所述荧光素酶报告基因载体为启动子增强子报告载体pGL3/4-basic；该启动子增强子报告载体pGL3/4-basic优选购自美国Promega公司。

优选地，在上述荧光素酶报告基因系统检测转录因子表达活性的方法中，所述步骤(2)包括：将目标细胞培养于含有胎牛血清、双抗的完全培养基中，并维持单层贴壁生长，于37℃下，在5％CO₂的培养箱中过夜培养，待细胞汇合度达到80％后，则可开始实施步骤(3)。

优选地，在上述荧光素酶报告基因系统检测转录因子表达活性的方法中，所述步骤(3)中转染的操作为：将所述待转染细胞以每孔100000个接种于24孔培养板中，将所述混合物与培养基加入该培养板，置于37℃下的5％CO₂培养箱中孵育6h后，吸弃所述混合物，再加新鲜培养基转染培养18～24h。

本发明还提供了一种细胞裂解缓冲液，用于上述荧光素酶报告基因系统检测转录因子表达活性的方法中。

优选地，在上述荧光素酶报告基因系统检测转录因子表达活性的方法中，所述细胞裂解缓冲液具有以下组分与配比：

0.2M KH₂PO₄ 4-4.5ml，如4.1-4.45ml、4.15-4.4ml、4.2-4.35ml、4.25-4.3ml；

0.2M K₂HPO₄ 44-48ml，如44.5-47ml、45-46.5ml、45.75-46.25ml；

MQ H₂O 48-52ml，如48.5-51.6ml、48.8-50.4ml、49.2-49.8ml；

Triton X-100 200μl。

本发明还提供了一种荧光素酶活性检测缓冲液，用于上述荧光素酶报告基因系统检测转录因子表达活性的方法中。

优选地，在上述荧光素酶报告基因系统检测转录因子表达活性的方法中，所述荧光素酶活性检测缓冲液具有以下组分与配比：

0.25M Tris pH7.8 700μl

1M MgSO₄ 100-115μl，如102-112μl，103-110μl，104-108μl，105-107μl；

dH₂O 5870-5880μl，如5872-5879μl，5875-5878μl；

0.25M ATP 250-300μl，如255-290μl，260-285μl，270-280μl，

Luc 43-50μl，如44-48.5μl，45-48μl，46-47μl。

值得说明的是，所述细胞裂解缓冲液和所述荧光素酶活性检测缓冲液中，各组分的配比虽然以数值与单位相结合的形式示出，但是，并不限于以上数值与单位相结合的形式，换言之，实际配制所述细胞裂解缓冲液和所述荧光素酶活性检测缓冲液中的各组分时，只要保证各组分用量比例符合上述配比即可。

优选地，在上述荧光素酶报告基因系统检测转录因子表达活性的方法中，所述步骤(4)包括：

(4.1)吸弃所述培养板中的培养基，加入400μl/孔预冷的PBS，冲洗所述被转染的细胞1-2次，然后吸弃PBS；

(4.2)向所述培养板的每个孔内加入50μl预先配制好的所述细胞裂解缓冲液A，接着，将所述培养板置于4℃的摇床中摇晃5-15分钟，摇晃过程中检查细胞是否脱落；

(4.3)收集裂解液，放入一套标记的1.5ml EP管中，用离心机在4℃下以12000rpm的转速离心10min，得上清液；

(4.4)现配所述荧光素酶活性检测缓冲液B，从中取146μl加入至另一套标记的1.5ml EP管中，并将该EP管插在冰上保持低温；

(4.5)取20μl(4.3)中所得的上清液加入至(4.4)中所述的EP管内，检测荧光素酶表达强度数据；

(4.6)检测荧光素酶浓度，校正；并计算出荧光素酶的表达量，从而检测出所述转录因子的表达活性。

在上述荧光素酶报告基因系统检测转录因子表达活性的方法中，由于所述转录因子的表达活性表现为能够激活靶基因启动子，因此，如果所述转录因子能够激活靶基因启动子，则荧光素酶基因就会表达，并且如图1所示，荧光素酶会催化荧光素酶活性检测缓冲液B中的荧光素(Luc)反应而产生荧光，而荧光素酶的表达量与所述转录因子的表达活性成正比。正是由于这一基因表达机制与相应正比关系的存在，上述荧光素酶报告基因系统检测转录因子表达活性的方法才能得以实施。

由此可见，本发明通过分子克隆的方法构建靶基因启动子区域荧光素酶报告基因质粒，用于检测细胞内转录因子的表达水平，进而应用于真核细胞转录因子表达机制的研究。

综上所述，发明人成功实施了一种荧光素酶报告基因系统检测转录因子表达活性的方法，该方法巧妙利用了荧光素酶自身持久稳定并且易于检测的特性，首先将包含靶基因启动子的荧光素酶报告基因载体与转录因子表达质粒共同转染至细胞，继续培养被转染的细胞后，将一定数量的细胞用细胞裂解缓冲液裂解，收集含有荧光素酶的裂解液，接着离心取上清液，然后在荧光素酶活性检测缓冲液内实时检测出荧光素酶表达强度数据，并同时测得荧光素酶浓度，校正后，即可计算得到所述转录因子的表达量，即所需要检测的转录因子的表达活性；由此可见，相较于现有技术，该方法的整个操作过程更加简单易行，耗时更短，通量更高，并且具有较高的可重复性与准确度。

此外，本发明还提供了一种细胞裂解缓冲液和荧光素酶活性检测缓冲液，用于所述的荧光素酶报告基因系统检测转录因子表达活性的方法，相较于购买相应的荧光检测工作液而言，成本更加低廉；当前，Promega公司垄断了荧光素酶表达活性检测行业绝大部分市场，其生产的1000次荧光检测试剂盒(含荧光检测工作液)的价格约为12000元；平均每个样品检测的价格达120元；100次检测至少160-200元/样左右；本发明所提供的荧光检测工作液的成本价格约为3000元，可以实施约3300次，相同价格下，可实施检测的次数是国外相应产品的12-15倍，因而具有极佳的价格优势，经济实惠。因此，本发明所提供的荧光素酶报告基因系统检测转录因子表达活性的方法、以及细胞裂解缓冲液和荧光素酶活性检测缓冲液，拥有现有的转录因子表达活性检测方法所不具备的上述综合优势，该方法在表达活性检测方面具有广阔的应用前景，并且具有优异的市场潜力。

附图说明

图1为本发明所述荧光素酶报告基因系统检测转录因子表达活性的方法中荧光素酶催化机理示意图，其中示出了荧光素发光反应式，可见，荧光素在荧光素酶催化下，且在Mg²⁺及ATP作用下发出了荧光；

图2为本发明所述荧光素酶报告基因系统检测转录因子表达活性的方法中优选的pGL3/4-basic载体的图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施方式。

本发明提供了一种荧光素酶报告基因系统检测转录因子表达活性的方法，包括以下步骤：

步骤(1)：根据待检测表达活性的转录因子的蛋白质组成，确定能与所述转录因子结合的靶基因启动子序列，以基因组DNA为模板，利用PCR反应进行扩增，获得靶基因启动子调控区片段；然后，将所述靶基因启动子调控区片段进行酶切纯化，筛选重组子；最后，将筛选到的靶基因启动子的特定片段插入荧光素酶报告基因载体，并且，插入后的所述靶基因启动子的特定片段位于荧光素酶Luc的表达序列的上游，从而制得包含靶基因启动子的荧光素酶报告基因载体；

步骤(2)：进行目标细胞的培养与铺板，得到待转染细胞；

步骤(3)：配制脂质体、所述包含靶基因启动子的荧光素酶报告基因载体和转录因子表达质粒的混合物，使用该混合物转染步骤(2)所制得的待转染细胞，获得被转染的细胞；

步骤(4)：将细胞裂解缓冲液A加至所述被转染的细胞，进行裂解，收集裂解液，接着，离心所收集的裂解液，取上清液，加入至荧光素酶活性检测缓冲液B中进行荧光素酶表达强度检测，并计算出荧光素酶的表达量，从而检测出所述转录因子的表达活性。

在一个优选实施例中，所述荧光素酶报告基因载体为启动子增强子报告载体pGL3/4-basic。其中，pGL3/4-basic载体图谱如图2所示。

在一个优选实施例中，所述步骤(2)包括：将目标细胞培养于含有胎牛血清、双抗的完全培养基中，并维持单层贴壁生长，于37℃下，在5％CO₂的培养箱中过夜培养，待细胞汇合度达到80％后，则可开始实施步骤(3)。

在一个优选实施例中，所述步骤(3)中转染的操作为：将所述待转染细胞以每孔100000个接种于24孔培养板中，将所述混合物与培养基加入该培养板，置于37℃下的5％CO₂培养箱中孵育6h后，吸弃所述混合物，再加新鲜培养基转染培养18-24h。

在一个优选实施例中，所述细胞裂解缓冲液A具有以下组分与配比：

在一个优选实施例中，所述荧光素酶活性检测缓冲液B具有以下组分与配比：

在一个优选实施例中，所述步骤(4)包括：

(4.1)吸弃所述培养板中的培养基，加入400μl/孔预冷的PBS，冲洗所述被转染的细胞1-2次，然后吸弃PBS；

(4.2)向所述培养板的每个孔内加入50μl预先配制好的所述细胞裂解缓冲液A，接着，将所述培养板置于4℃的摇床中摇晃5-15分钟，摇晃过程中检查细胞是否脱落；

(4.3)收集裂解液，放入一套标记的1.5ml EP管中，用离心机在4℃下以12000rpm的转速离心10min，得上清液；

(4.4)现配所述荧光素酶活性检测缓冲液B，从中取146μl加入至另一套标记的1.5ml EP管中，并将该EP管插在冰上保持低温；

(4.5)取20μl(4.3)中所得的上清液加入至(4.4)中所述的EP管内，检测荧光素酶表达强度数据；

(4.6)检测荧光素酶浓度，校正；并计算出荧光素酶的表达量，从而检测出所述转录因子的表达活性。

下述实施例中的步骤如无特别说明均为常规操作，所述试剂如无特别说明均能从公开商业途径获得。

实施例1

购买的主要试剂与仪器：

启动子增强子报告载体pGL3/4-basic(质粒)购自美国Promega公司；PBS(磷酸盐缓冲液)购自HyClone公司；Lipofectamin^TM2000脂质体购自Invitrogen公司；荧光表达强度检测仪为Promega Glomax 20/20生物/化学发光检测仪。试剂配制：

100ml细胞裂解缓冲液A(实验前预先配制)，其中：

6988μl荧光素酶活性检测缓冲液B(以2*24孔为例，实验开始后现配)，其中：

开始实验，操作步骤如下：

(1)：明确转录因子的蛋白质组成，确定能与所述转录因子结合的靶基因启动子序列，以基因组DNA为模板，利用PCR反应进行扩增，获得靶基因启动子调控区片段；然后，将所述靶基因启动子调控区片段进行酶切纯化，筛选重组子；最后，将筛选到的靶基因启动子的特定片段插入荧光素酶报告基因载体，并且，插入后的所述靶基因启动子的特定片段位于荧光素酶Luc的表达序列的上游，从而制得包含靶基因启动子的荧光素酶报告基因载体；

(2)：将目标细胞培养于含有10％胎牛血清且含有双抗的完全培养基中，并维持单层贴壁生长，于37℃下，在5％CO₂的培养箱中静置过夜培养，观察目标细胞生长状态，待目标细胞生长至对数期时分别用台盼蓝计数，以100000每孔的细胞量接种于24孔培养板中，置于37℃下的5％CO₂培养箱中培养，待细胞汇合度达到80％时，得到待转染细胞，开始实施以下步骤(3)；

(3)：配制包含靶基因启动子的启动子增强子报告载体pGL3/4-basic/转录因子表达质粒/Lipofectamin^TM2000脂质体的混合物，使用该混合物转染所述待转染细胞，获得被转染的细胞，具体包括以下步骤：

(3.1)将300ng的包含靶基因启动子的启动子增强子报告载体pGL3/4-basic、60ng的转录因子表达质粒，溶于50μl无血清培养基中稀释，室温下孵育5min；

(3.2)将2μl的Lipofectamin^TM2000脂质体以同样的方式溶于50μl无血清培养基中稀释，室温下孵育5min；

(3.3)轻柔混匀(3.1)与(3.2)中配制的试剂，室温静置20～30分钟，得到包含靶基因启动子的启动子增强子报告载体pGL3/4-basic/转录因子表达质粒/Lipofectamin^TM2000脂质体的混合物；

(3.4)吸弃24孔培养板中的原培养基，然后用PBS(磷酸盐缓冲液)清洗3次，将所述待转染细胞以每孔100000个接种于该24孔培养板中，每孔加入500μl无血清培养基，再将所述混合物逐滴加入该培养板中，并轻轻摇板均匀，置于37℃下的5％CO₂培养箱中孵育6h后，吸弃所述混合物，再加新鲜培养基转染培养18-24h，获得被转染的细胞；

(3.5)对照组用pGL3/4-basic空载体实施平行转染，每组均做3副孔重复3次以保证实验结果的准确性。

(4)：将细胞裂解缓冲液A加至所述被转染的细胞，进行裂解，收集裂解液，接着，离心所收集的裂解液，取上清液，加入至荧光素酶活性检测缓冲液B中进行荧光素酶表达强度检测，并计算出荧光素酶的表达量，从而检测出所述转录因子的表达活性，具体操作如下：

(4.1)吸弃所述被转染的细胞所在培养板中的培养基，加入400μl/孔预冷的PBS，冲洗所述被转染的细胞1-2次，然后吸弃PBS；

(4.2)向所述培养板的每个孔内加入50μl预先配制好的所述细胞裂解缓冲液A，接着，将所述培养板置于4℃的摇床中摇晃5-15分钟，摇晃过程中检查细胞是否脱落；

(4.3)收集裂解液，放入一套标记的1.5ml EP管中，用离心机在4℃下以12000rpm的转速离心10min，得上清液；

(4.4)现配所述荧光素酶活性检测缓冲液B，从中取146μl加入至另一套标记的1.5ml EP管中，并将该EP管插在冰上保持低温；

(4.5)取20μl(4.3)中所得的上清液加入至(4.4)中所述的EP管内，检测荧光素酶表达强度数据；

(4.6)检测荧光素酶浓度，校正；并计算出荧光素酶的表达量，从而检测出所述转录因子的表达活性。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。