一种文竹中期染色体的荧光原位杂交方法与流程

本发明属于分子细胞遗传学技术领域，具体涉及一种文竹中期染色体的荧光原位杂交方法。

背景技术：

文竹，又名云片松、刺天冬、云竹，是百合科天门冬属多年生草质藤本植物。文竹叶片轻柔，竹形优雅，常年翠绿，是著名的室内盆花，也是小型盆景和切花的优良衬叶材料，具有极高的观赏价值。其根可入药，可治急性气管炎，具有润肺止咳的功能。对文竹的研究目前主要集中在栽培技术等方面，对其细胞学的研究相对滞后，这主要是由于文竹的种子发芽比较困难，叶片呈针状，而茎尖生长点也较难于取材，很难获得理想的制备玻片标本的材料，且其细胞质浓厚，细胞壁较坚硬，处理细胞比较困难，染色体较小，很难获得形态清晰、分散良好的分裂相。因此，适合于文竹的染色体玻片标本制备和高分辨率的核型分析技术有待开发。

荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization, FISH）是根据核酸碱基互补配对原则，将经过标记的外源核酸（探针）直观的定位到染色体或染色质上的一种分子细胞遗传学方法。该技术是20世纪70年代末80年代初在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种重要的非放射性原位杂交技术。与原有的放射性原位杂交技术相比，该技术具有安全性高、操作简便快速、稳定性和可重复性强、同一张玻片可同时检测多个探针等优点。目前，该方法已经广泛应用于物理图谱构建、转基因检测及定位、异源染色质鉴定、染色体畸变检测、基因组结构解析和物种亲缘关系和进化分析等方面。但是，在FISH技术操作过程中，染色体玻片标本质量、探针标记的方法和效率、探针和染色体共变性的温度和时间均影响实验结果，如染色体玻片标本的质量是FISH能否杂交成功的关键因素之一，酶解不足或过度都会导致染色体制片的失败；玻片细胞质太浓，探针不容易杂交且会造成高背景；预处理是否合适决定着染色体长度是否适中，是否有利于杂交。探针标记的方法不同，也会相应的影响杂交结果。探针和染色体共变性的温度和时间也是重要的因素，如果共变性温度低或时间短，双链没有完全打开，不会杂交出特异信号，而共变性温度过高或时间过长都会导致染色体膨胀变形，使实验结果不正常。FISH技术已在很多植物上运用成功，但是，目前还未见在文竹中荧光原位杂交技术应用的报道。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是提供了一种操作简便，省时省力，稳定性和重复性高的文竹中期染色体的荧光原位杂交方法，该方法观察到的文竹中期染色体的形态完好，信号清晰。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种文竹中期染色体的荧光原位杂交方法，其特征在于：以文竹中期染色体作为靶DNA，以玉米45S rDNA或/和5S rDNA为探针进行文竹染色体荧光原位杂交。

本发明所述的文竹中期染色体的荧光原位杂交方法，其特征在于具体步骤为：

（1）染色体玻片标本的制备，将盆栽文竹控水三天，然后浇水，在浇水的第二天早上9:00-10:00取根尖，用N₂O处理2h后，体积百分数为90%的乙酸冰上固定10min，固定后用去离子水冰上水洗10min，然后切取根尖分生组织区，置于质量体积百分比分别为1%果胶酶和2%纤维素酶的混合液中于37℃酶解2h，酶解完成后用体积百分数为70%的乙醇清洗根尖两次，然后在40μL乙醇中用解剖针捣碎根尖，涡旋悬浮细胞，离心保留沉淀并加入30μL无水乙酸，混匀后吸取5-8μL滴片，室温放置5min后进行镜检，镜检良好的玻片放紫外交联仪中经过120-125mJ/cm²处理2min固定染色体得到染色体玻片标本备用；

（2）玉米45S rDNA或/和5S rDNA探针标记，将下列各组分在冰上分别加入离心管，玉米45S rDNA或/和5S rDNA 2μg、10×nick translation buffer 2µL、Labeled-dNTP 0.5µL、Non-labeled-dNTPs 2µL、DNA polymerase I 5µL和DNaseI 0.5µL，再用去离子水补至20µL，混合均匀后在PCR仪中于15℃处理2h，加入质量浓度为140ng/µL鲑精DNA 175µL，再加入体积百分数为90%的乙醇450µL和摩尔浓度为3mol/L的乙酸钠50µL，混合均匀后沉淀探针2h以上，然后置于离心机中于13000rpm的离心速率离心处理30min，再用乙醇清洗两遍，将沉淀的探针室温避光30min进行干燥；

（3）杂交与杂交后洗脱，在0.5μL步骤（2）得到的标记探针中加入20µL 2×SSC 1×TE得到探针溶液，在步骤（1）得到的染色体玻片标本上有细胞的地方加上探针溶液，盖上塑料盖玻片，再将染色体玻片标本置于铺有湿润纸巾的金属容器中，沸水浴处理5min，然后将染色体玻片标本放入杂交盒中于55℃杂交3h以上，再将染色体玻片标本取出放入2×SSC中5min，除去塑料盖玻片；

（4）信号检测，在步骤（3）处理后的染色体玻片标本上加20µL含抗淬灭剂的DAPI荧光染液染色10min，盖上长盖片进行检测。

本发明具有以下有益效果：

（1）本发明在现有技术的基础上，用先控水再浇水的方法处理文竹，可使文竹根尖分生组织分裂活动旺盛，有利于获得大量中期分裂相；

（2）本发明采用N₂O预处理文竹根尖，并采用酶解滴片法制备中期染色体玻片标本，可有助于去除细胞质背景，使染色体分散良好，且方法简单，不需要加盖片去盖片等繁复的步骤，无污染；

（3）本发明探针制备采用缺口平移法将荧光素直接标记到探针上，标记效率高，且在后续的原位杂交过程中不需要加抗体可直接检测，可提高杂交特异性；

（4）在探针和染色体共变性时采用沸水浴进行变性，确立了合适的时间，并在共变性结束后直接进行杂交，无需冷却，操作简便无污染，且得到的文竹染色体形态完好，变性完全，信号点清晰，数目稳定；

（5）本发明采用55℃高温复性杂交，杂交后洗脱采用短时2×SSC室温洗脱，提高特异性的同时，操作简单且省时；

（6）本发明整个操作步骤简单，节约了大量时间，便于快速的获得探针在文竹染色体上的定位信息；

（7）本发明清楚地显示了文竹的染色体，荧光信号清晰，杂交特异性高，确立了适合文竹的中期染色体制备和FISH方法；

（8）本发明将玉米45S rDNA和5S rDNA探针清晰的定位在了文竹中期染色体上，可分辨同源染色体和非同源染色体，有助于核型分析，对于文竹染色体物理图谱构建、遗传育种、染色体鉴定和结构研究，以及天门冬属植物的进化研究等具有重要的理论和实践意义。

附图说明

图1为45S rDNA在文竹中期染色体上信号位点分布图像（A为DAPI复染的染色体，B为Alexa Fluor-488荧光素标记的45S rDNA的信号位点，C为合成图）；

图2为5S rDNA在文竹中期染色体上信号位点分布图像（A为DAPI复染的染色体，B为Texas red荧光素标记的5S rDNA的信号位点，C为合成图）；

图3为45S rDNA和5S rDNA同时在文竹中期染色体上信号位点分布图像（A为DAPI复染的染色体，B为Alexa Fluor-488荧光素标记的45S rDNA的信号，C为Texas red荧光素标记的5S rDNA的信号，D为A、B和C的合成图）。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例

（1）染色体玻片标本的制备，将盆栽文竹控水三天，然后浇水，在浇水的第二天早上9:00-10:00取根尖，用N₂O处理2h后，质量百分数为90%的乙酸冰上固定10min，固定后用去离子水冰上水洗10min，然后切取根尖分生组织区，置于质量体积百分比分别为1%果胶酶和2%纤维素酶的混合液中于37℃酶解2h，酶解完成后用体积百分数为70%的乙醇清洗根尖两次，然后在40μL乙醇中用解剖针捣碎根尖，涡旋悬浮细胞，离心保留沉淀并加入30μL无水乙酸，混匀后吸取5-8μL滴片，室温放置5min后进行镜检，镜检良好的玻片放紫外交联仪中经过120-125mJ/cm²处理2min固定染色体得到染色体玻片标本备用；

（2）玉米45S rDNA或/和5S rDNA探针标记，将下列各组分在冰上分别加入离心管，玉米45S rDNA或/和5S rDNA 2μg、10×nick translation buffer 2µL、Labeled-dNTP 0.5µL、Non-labeled-dNTPs 2µL、DNA polymerase I 5µL和DNaseI 0.5µL，再用去离子水补至20µL，混合均匀后在PCR仪中于15℃处理2h，加入质量浓度为140ng/µL鲑精DNA 175µL，再加入体积百分数为90%的乙醇450µL和摩尔浓度为3mol/L的乙酸钠50µL，混合均匀后沉淀探针2h以上，然后置于离心机中于13000rpm的离心速率离心处理30min，再用乙醇清洗两遍，将沉淀的探针室温避光30min进行干燥；

（3）杂交与杂交后洗脱，在0.5μL步骤（2）得到的标记探针中加入20µL 2×SSC 1×TE得到探针溶液，在步骤（1）得到的染色体玻片标本上有细胞的地方加上探针溶液，盖上塑料盖玻片，再将染色体玻片标本置于铺有湿润纸巾的金属容器中，沸水浴处理5min，然后将染色体玻片标本放入杂交盒中于55℃杂交3h以上，再将染色体玻片标本取出放入2×SSC中5min，除去塑料盖玻片；

（4）在步骤（3）处理后的染色体玻片标本上加20µL含抗淬灭剂的DAPI荧光染液染色10min，盖上长盖片（22mm×40mm）进行检测。用Olympus BX63荧光显微镜观察，CCD拍照，Metamorph软件进行染色体分析，Photoshop进行图像处理，结果如图1、图2和图3所示，通过荧光显微镜可以观察到明亮的杂交信号。

以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。