微流控凝胶气液界面烟气暴露装置的制作方法

本发明涉及一种烟气暴露，尤其涉及一种微流控凝胶气液界面烟气暴露装置。

背景技术：

一直以来，卷烟烟气对人体的健康风险广受关注。有研究报道显示，吸烟者相对于非吸烟者，患肺癌、慢性阻塞性肺病和急性心肌梗塞的可能性会不同程度地增加。研究表明在卷烟烟气导致的多种吸烟相关疾病中，氧化应激是关键的病理生理学机制。卷烟烟气是一种复杂的混合物，其中氧化性物质会诱导细胞内活性氧(ROS)增加，卷烟烟气诱导机体产生的ROS会对细胞内蛋白质、脂质和DNA等造成损伤。但是现有的评估平台对其形成机理、成分危害性等研究都比较局限。因此，开发对细胞的体外毒性研究平台，评估烟气对健康的具体危害性，很有必要。

卷烟烟气是一种由几千种化学物质组成的复杂的气溶胶，由粒相物和气相物两部分所构成。目前卷烟烟气毒理学研究大多集中于烟气粒相物的毒性研究方面，染毒方式多以溶液暴露为主，与卷烟烟气实际的呼吸道气液界面暴露条件有着巨大的差异，不能全面真实地反映烟气混合物体系的生物学效应。而现在对全烟气直接暴露的研究，多采用商品化装置如日本的Cultex和德国的Vitrocell，这两种设备基本相同，暴露方式均是气液界面暴露。但是此类暴露装置体积庞大、价格昂贵，普通实验室难以负担，限制了此类装置的推广和普及。此外，卷烟由于其天然产物的特性，不同产地和不同批次间均有比较明显的差异，因此对于其毒性的评估需要大量的工作，现有的设备完全难以满足毒性评估的基本需求。因此，急需建立一种实验室使用的简单便利的气液界面细胞暴露平台用于气体毒性评。

技术实现要素：

发明目的：本发明的目的是提供一种用于实验室研究、便携式而廉价的烟气暴露装置。

技术方案：本发明所述的微流控凝胶气液界面烟气暴露装置，包括提供烟气进出通道的上层芯片、提供细胞培养液流动通道的下层芯片以及位于上下层芯片之间用于装载凝胶和位于凝胶上细胞的中间层芯片；其中，下层芯片内的细胞培养液为中间层芯片内的细胞提供生存环境，中间层芯片内的凝胶成为气液界面并使其细胞与烟气直接接触。

其中，所述上层芯片包括并列设置的气体进出通道以及位于通道两侧的气体入口和气体出口，其中，气体入口至少有两个，气体出口数量没有限制，例如两个入口通入两种不同的气体，相互稀释以形成气体浓度梯度，如此可在一张芯片上，同时实现不同条件下对细胞进行刺激实验，通过一次实验就得出多个情况下细胞受刺激的结果。

类似的，所述下层芯片包括并列设置的液体流动通道以及位于通道两侧的培养液入口和废液出口，其中，培养液入口至少有两个，废液出口没有限制，以形成液体浓度梯度。

所述中间层芯片包括由细胞培养孔构成的阵列结构，该细胞培养孔与上下层芯片中的通道相通，同时细胞培养孔内装载凝胶和细胞，凝胶与下层芯片中的细胞培养液直接接触。

本发明中，中间层芯片本体是不能透过气体或者液体的，因此在上面开设细胞培养孔，孔内填充凝胶，凝胶上表面培养细胞，此时凝胶起到了间隔和沟通气液的作用；这样下层的溶液能够透过凝胶渗透将营养物质输送给细胞，同时将细胞的代谢产物通过凝胶渗透到液体中带走，维持细胞环境的稳定。此外，采用阵列结构可以实现阵列化大批量检测。

本发明中，上层芯片和下层芯片中的通道方向垂直或平行。上层芯片中，每一列是一种气体的浓度条件，下层芯片中，每一列是一种液体的浓度条件，以4*4阵列为例，一共4列，每列有4个细胞是在同一条件下受刺激实验。同样，若是设计成6*6阵列，可以根据需要同时改变相应的液体通道。此时如果液体入口是两种不同浓度的液体，气体入口是两种不同浓度的气体，气液通道相垂直，可在芯片上实现16个不同条件下的刺激；气液通道也可以相平行，此时可在芯片上实现4个不同条件下的刺激。

所述上层芯片、中间层芯片及下层芯片由聚二甲基硅氧烷层与塑料层复合而成。其中，塑料层由聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯或聚丙烯或聚对苯二甲酸乙二醇酯制成。

所述凝胶为能够满足细胞生物相容性的凝胶。其中，凝胶为琼脂糖、胶原水凝胶、聚L-赖氨酸或壳聚糖。

本发明中，可以再下层芯片的细胞培养液中添加刺激药物形成细胞溶液暴露装置，实现对细胞的刺激实验。在模拟体内细胞生长环境的条件下，对细胞进行刺激，以观察细胞的生存代谢情况。使用溶液暴露装置，可实现对药物的筛选，以评估药物的药效，这对于药物研发有重要意义；同时也可以模拟体内细胞受烟气等污染物刺激，损伤情况。例如，将烟气提取物溶于细胞培养液中，暴露刺激细胞，可检测细胞中ROS、各种转录因子的变化情况。

有益效果：与现有技术相比，本发明的显著优点为：该烟气暴露装置包括上、中、下三层芯片结构；其中，上层芯片可通入卷烟烟气，以便刺激细胞；中间层芯片用于细胞装载和培养，下层芯片通细胞培养液，以持续不断提供养分，并实时输出细胞代谢物。本发明中细胞位于凝胶上方，不与细胞培养液直接接触，避免了培养液对细胞表面造成直接冲击；同时培养液又可通过凝胶供给细胞且保持细胞生存环境稳定；在此基础上细胞可与烟气气体直接接触，从而获得烟气对细胞刺激的相关生物学信息。

附图说明

图1是本发明烟气暴露装置上层芯片的结构示意图；

图2是本发明烟气暴露装置中间层芯片的结构示意图；

图3是本发明烟气暴露装置下层芯片的结构示意图；

图4是本发明烟气暴露装置整体结构图；

图5是本发明烟气暴露装置某一横列的局部剖面图；

图6是本发明烟气暴露装置的实验对照组细胞活性图；

图7是本发明烟气暴露装置的烟气暴露组细胞活性图。

图中：1-上层芯片的气体管道；2-气体入口；3-气体出口；4-中间层芯片的细胞培养孔；5-下层芯片的液体通道；6-培养液入口；7-废液出口；8-细胞；9-凝胶；10-活细胞；11-凋亡细胞；12-坏死细胞。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

一、芯片平台的制作过程

1.上层芯片：将未固化的聚二甲基硅氧烷(PDMS前聚体：固化剂＝10:1)，铺到上层芯片模板上，真空抽气10min以除去气泡，加热台70℃加热固化45min，揭下，在指定位置打孔，即得到上层芯片，见图1。

2.中间层芯片：使用激光雕刻机，对0.5mm厚的有机塑料板雕刻4*4阵列的孔状结构，孔径1mm，即可用于细胞装载，见图2。

3.下层芯片：将未固化的聚二甲基硅氧烷(PDMS前聚体：固化剂＝10:1)，铺到下层芯片模板上，真空抽气10min以除去气泡，加热台70℃加热固化45min，揭下，在指定位置打孔，即得到下层芯片，见图3。

4.中间层细胞培养孔与上、下层芯片通道垂直对应，芯片紧密贴合，构成完整的微流控凝胶气液界面细胞培养和烟气暴露平台，见图4-5。

二、芯片细胞装载和培养

1.使用磷酸盐缓冲溶液(PBS)配制2％的低熔点琼脂糖凝胶溶液，置于70℃水浴中溶解，震荡形成均匀水溶液。

2.处理细胞，得10⁶cell/L的细胞溶液。

3.将经过10min紫外光灭菌处理下层和中间层取出、贴合，使用移液枪依次移取2％凝胶0.7μL注入微孔，将芯片放入4℃冰箱5min，凝胶固化。

4.使用移液枪再次依次移取0.7μL细胞溶液注入微孔。

5.使用注射泵和5mL注射器，以5μL/min速度连续灌注细胞培养液24小时。

6.观察细胞活性情况。

三、芯片细胞烟气暴露

1.按以上所述，将细胞装载到芯片上。

2.同样使用注射泵和5mL注射器，以5μL/min速度连续灌注细胞培养液。

3.将烟气收集于烟气袋中，连接于气体入口；气体出口连接气体流量计和真空发生器；即可实现一定烟气流速的细胞烟气暴露，实验以8mL/min流速暴露20min。

4.使用荧光探针染料AO-EB孵育细胞，荧光观察，如图7所示。

5.图6为实验对照组，即未经过烟气刺激，正常培养的细胞活性情况。

6.由此计算获得烟气对细胞活性影响情况，依据公式：细胞死亡率＝(凋亡细胞+坏死细胞)/细胞总数。

7.图6为实验对照组，细胞死亡率≤5％；图7为烟气暴露组，细胞死亡率≥50％；由此可看出通过烟气对细胞造成了损伤，该装置可有效地用于实验研究。

本发明将气液界面引入微流控芯片，可以实现对人体肺部细胞暴露在气体环境中实际状态的良好模拟，并对重要的氧化应激毒性指标进行在线检测，同时兼具微型化、自动化和廉价的特点。因此，本发明基于微流控芯片技术，研发气液界面细胞暴露以及相应的烟气氧化应激毒性指标的快速检测平台，对于卷烟烟气危害性评价及其毒性作用机制的研究有着重要的意义。