开关型硫醇荧光标记试剂及其合成方法和应用与流程

本发明涉及荧光标记试剂，具体涉及一种开关型硫醇荧光标记试剂及其合成方法和应用。

背景技术：

在硫醇化合物的高效液相色谱分析中，马来酰亚胺类荧光标记试剂具有独特的优势：(1)与传统的芳基卤化物、苯并呋喃磺酰卤等试剂相比，它们与硫醇反应速度快，在室温及生理pH下即可进行。(2)对巯基的选择性高，加成产物比较稳定。(3)自身无荧光或荧光很弱，在与硫醇加成后荧光增强，这种荧光开关效应极大地降低了检测过程中的背景信号干扰。

然而目前可应用的马来酰亚胺类荧光标记试剂数量有限，并且与硫醇加成产物荧光开关效应不明显，合成步骤复杂，因此有必要开发一种标记反应迅速、荧光开关效应好、合成方法简便的开关型马来酰亚胺类荧光标记试剂。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种标记反应迅速、对硫醇选择性高、无背景干扰、合成方法简便的开关型硫醇荧光标记试剂；本发明同时提供其合成方法和应用。

本发明所述的开关型硫醇荧光标记试剂是以咔唑为荧光基团，马来酰亚胺为反应活性基团，其化学名为：N-(9-乙基-咔唑)-马来酰亚胺，其化学结构式是：

所述的开关型硫醇荧光标记试剂的合成方法，包括以下步骤：

(1)将顺丁烯二酸酐溶解到乙腈中，常温下滴加含有3-氨基-9-乙基-咔唑的乙腈溶液进行反应，反应完毕，除去溶剂，得到中间体N-(9-乙基-咔唑)-马来酰胺酸；

(2)用乙酸酐将N-(9-乙基-咔唑)-马来酰胺酸溶解，加入无水乙酸钠进行反应，反应完毕冷却，再倒入水中淬灭反应，回收固体后，经干燥、重结晶得到目标产物N-(9-乙基-咔唑)-马来酰亚胺。

其中：

步骤(1)中顺丁烯二酸酐和3-氨基-9-乙基-咔唑的摩尔比为1.1～1.4:1。

步骤(1)中滴加完毕后，继续反应0.8～1小时。

步骤(1)中反应完毕后，通过旋转蒸发除去溶剂。

步骤(2)中无水乙酸钠与N-(9-乙基-咔唑)-马来酰胺酸的摩尔比为1:5～8。

步骤(2)中加入无水乙酸钠后，在100℃下反应0.8～1小时。

步骤(2)中采用乙腈重结晶三次。

所述的开关型硫醇荧光标记试剂的应用，即检测硫醇浓度的方法，包括如下步骤：

(1)配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液；配制5份硫醇标准品的乙腈溶液，浓度分别为1μM、10μM、100μM、1mM、10mM；配制浓度为100mM的N-(9-乙基-咔唑)-马来酰亚胺的乙腈溶液；

(2)依次将50μL PBS缓冲溶液、100μL硫醇标准品的乙腈溶液和50μL N-(9-乙基-咔唑)-马来酰亚胺的乙腈溶液加到2mL的安剖瓶中，于40℃的水浴中反应10分钟，反应完毕后，取10μL进入高效液相色谱仪中分析，设置荧光激发波长为274nm，荧光发射波长为363nm，得到硫醇标准品色谱图，以硫醇浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制硫醇浓度工作曲线；

(3)将样品用开关型硫醇荧光标记试剂标记后，进入高效液相色谱仪中分析，将所得到的峰面积代入硫醇浓度工作曲线中，即可求得样品中硫醇的浓度。

本发明的有益效果如下：

本发明的开关型硫醇荧光标记试剂是以咔唑为荧光团，马来酰亚胺为反应活性基团，其中马来酰亚胺环与咔唑荧光团直接相连，由于马来酰亚胺环的强吸电子效应，使标记试剂的量子产率显著下降，表现为无荧光。

本发明试剂自身不发荧光，可在中性条件下选择性地与硫醇化合物反应，生成具有强荧光的衍生产物，极大地降低硫醇检测过程中的背景干扰；标记反应具有高选择性，在生理pH值下只和硫醇发生反应；标记反应速度快，对硫醇的标记反应可在10分钟内完成；标记试剂合成步骤简单，化学性质稳定，产率较高，经分离提纯后，化学纯度达99.6％以上，具有标记反应速率快、标记产率高、对硫醇选择性高等优点，有利于增强硫醇类化合物分析的准确性和灵敏性，可应用于生命分析、环境分析、食品分析等研究领域中，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是实施例1N-(9-乙基-咔唑)-马来酰亚胺的合成路线图。

图2是实施例1N-(9-乙基-咔唑)-马来酰亚胺的核磁¹HNMR图。

图3是实施例2试剂和其硫醇衍生物的荧光发射图。

图4是实施例3试剂与巯基化合物的反应路线图。

图5是实施例3试剂衍生5种硫醇标准品的色谱图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步描述。

实施例1

如图1所示，本发明的开关型硫醇荧光标记试剂的合成共有2步，以顺丁烯二酸酐和3-氨基-9-乙基-咔唑为原料，具体合成操作如下：

1、中间体N-(9-乙基-咔唑)-马来酰胺酸的制备：

在250mL的圆底烧瓶中加入5g顺丁烯二酸酐和100mL乙腈，开始搅拌；在顺丁烯二酸酐完全溶解后，滴加含有9.7g 3-氨基-9-乙基-咔唑的乙腈溶液，得到白色的悬浮液，并继续搅拌1小时；反应完后旋转蒸发除去溶剂，得到中间体N-(9-乙基-咔唑)-马来酰胺酸13.7g，产率96％。

2、目标产物N-(9-乙基-咔唑)-马来酰亚胺的制备：

用70mL乙酸酐将所得的N-(9-乙基-咔唑)-马来酰胺酸溶解，加入0.7g无水乙酸钠，于100℃油浴下反应1小时；冷却后，倒入水中淬灭反应，将固体抽滤并干燥，用乙腈重结晶三次，得到淡黄色晶体，为目标产物N-(9-乙基-咔唑)-马来酰亚胺。9.6g，产率74％。

产物表征如下：

¹HNMR(CDCl₃,400MHz,ppm)δ8.41(d,1H,Ar-H),8.16(d,1H,Ar-H),7.80-7.85(dd,2H,-CH-CH-,J＝8.0Hz),7.53(m,1H,Ar-H),7.45(dd,2H,J＝8.0Hz),7.41(s,1H,Ar-H),7.3(m,1H,Ar-H),4.4(m,2H,-CH₂-),1.47(t,2H,-CH₃).(图2)

IR(KBr):3470(NH₂),2962(-CH₃),2875,3056,1600(ph),1644(-C＝O)；

Found:C 74.44,H 4.72,N 9.74,O 11.16；Calculated:C 74.47,H 4.86,N 9.65,O 11.05；MS:m/z 290.1[M+H]⁺.

实施例2

为了验证荧光标记试剂的荧光性质，用乙腈配制浓度为1μM的N-(9-乙基-咔唑)-马来酰亚胺溶液和相同浓度的己硫醇衍生物溶液，如图3所示，在与己硫醇反应前，该试剂几乎无荧光，反应后荧光显著增强。荧光最佳激发和发射波长分别为274nm和363nm。同时，以色氨酸标准溶液为参比溶液，计算了N-(9-乙基-咔唑)-马来酰亚胺和其硫醇衍生物的荧光量子产率。经计算，N-(9-乙基-咔唑)-马来酰亚胺的量子产率为0.004，与硫醇反应后量子产率为0.388。

实施例3

利用该荧光标记试剂检测咖啡中的硫醇含量，配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液；配制5种硫醇标准品(3-巯基-甲基甲酸丁酯，3-巯基-3甲基丁基醇，2-甲基-3-四氢呋喃硫醇，糠基硫醇，3-巯基-己醇)一系列浓度的乙腈溶液，浓度分别为1μM、10μM、100μM、1mM、10mM，将相同浓度的不同种类的硫醇标准品的乙腈溶液进行混合，得到5个硫醇混合标准品溶液；配制浓度为100mM的N-(9-乙基-咔唑)-马来酰亚胺的乙腈溶液。

(2)依次将50μL PBS缓冲溶液、100μL硫醇混合标准品溶液和50μL N-(9-乙基-咔唑)-马来酰亚胺溶液加到2mL的安剖瓶中，于40℃的水浴中反应10分钟。N-(9-乙基-咔唑)-马来酰亚胺与硫醇反应式如图4。反应完成后取10μL进入高效液相色谱仪中分析，设置荧光激发波长为274nm，荧光发射波长为363nm，得到硫醇标准品色谱图，在10分钟内实现了5种硫醇分析物的完全分离，图5为浓度为1×10^-6mol/L的硫醇混合标准品色谱图。以硫醇浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制硫醇浓度的标准曲线。

(3)将咖啡样品用荧光标记试剂标记后，进入高效液相色谱仪中分析，将所得到的峰面积代入工作曲线中，即可求得咖啡样品中硫醇的浓度。