本发明涉及一种筛选高产量金霉素诱变菌株的方法，属于微生物生产技术领域。
背景技术：
金霉素(Chorotetracycline，即CTC)属于四环素类的一种广谱抗生素。金霉素能够抑菌、促生长、饲料利用率高、在肌体内残留量低。其生产技术已经较为成熟，生产成本也较低，成为目前饲料工业中用量最大的抑菌促生长剂。目前国内工厂金霉素的产率还较低(效价在18000μg/mL左右)，因此提高金霉素的产率很有必要。金霉素是由金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)发酵得到的次级代谢产物，其产量合成性状受多基因决定，代谢网络复杂。影响金霉素发酵过程的因素也很多，如种子的质量、培养基的组成、工艺条件以及发酵过程的代谢控制等。目前微生物育种技术已经从诱变、推理、重组技术发展到代谢工程、系统生物学和异源生物合成等方法。但传统诱变育种仍具有诸多优势。如不需要知道生物遗传背景、代谢模型，只需要获得有效突变库和定向筛选。高通量筛选与常规诱变结合，适用于以提高次级代谢产物产量为目标的工业生产菌株选育，尽可能减少漏筛现象。
现有的金霉素菌株的筛选，一般是采用摇瓶发酵后用HPLC方法进行检测，存在培养周期长、检测所需时间长、检测方法繁琐等缺陷。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供了一种金霉素高产菌株的高效筛选方法。本发明方法结合了常压室温等离子体(ARTP)、酶标仪检测和高通量筛选技术，提高金霉素高产菌株的筛选效率。
所述出发菌株金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)是由齐鲁制药(内蒙古)有限公司提供的工业生产菌株。
本发明的金霉素高产菌株的高效筛选方法，主要包括步骤如下：
(1)将待筛选的金色链霉菌菌悬液涂布在固体平板培养基上，待孢子成熟后挑选接种于装有种子培养液的96浅孔板中培养；
(2)将96浅孔板中得到的种子液平行转接至装有发酵培养液的48孔板中发酵培养；
(3)发酵结束后，离心取菌体，吸取上清液稀释至金霉素浓度为0～20mg/L，然后取稀释液100μL添加到提前加入40μL Tris-HCl缓冲溶液和60μL Sm(NO)3溶液的96孔板中，震荡混匀，8min后显色完全，酶标仪测定各浓度的OD405值，根据y＝0.0112x-0.009，R2＝0.99905(其中，x为金霉素浓度浓度(μg/mL)，y为OD405nm)计算得到金霉素浓度，进而根据稀释倍数换算得到发酵液的金霉素浓度，即得到产金霉素相对较高的菌株。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)的固体平板培养基上的培养是在34℃培养4d。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)的固体平板培养基配方(g/L)：蔗糖20g，进口酵母粉0.5g，KH2PO40.8g，琼脂18g。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)的种子培养液(g/L)：蔗糖30g，进口酵母粉5g，MgSO40.5g，(NH4)2SO43g，NaCl 4g，KH2PO41g，CaCO30.2g。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)的96浅孔板中培养是在750r/min、30～32℃摇床培养23～25h。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)的发酵培养液(g/L)：蔗糖30g，MgSO40.5g，CaCO30.33g，柠檬酸2.55g，(NH4)2SO43g，1mL混合液(0.3％CuSO4·5H2O、0.5％ZnSO4·7H2O、0.25％MnSO4`4H2O)。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)的发酵培养是将种子液以8％(v/v)的接种量转接至48孔板中，于750r/min、30～31℃发酵培养96～110h。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)的离心是在4000r/min离心15min。
在本发明的一种实施方式中，所述待筛选的金色链霉菌菌悬液，是将金色链霉菌进行诱变后得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述诱变，可以是物理诱变或者化学诱变，比如常压室温等离子体(ARTP)诱变、紫外诱变、甲基磺酸乙酯(EMS)诱变、亚硝基胍(NTG)诱变、硫酸二乙酯(DES)诱变等等。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)96浅孔板中种子培养液添加量为180μL/孔。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)48孔板中发酵培养液的添加量为1000μL/孔。
在本发明的一种实施方式中，所述Tris-HCl缓冲溶液的pH为6.7，Sm(NO)3溶液的浓度为5×10-4mol/L。
本发明的有益效果：
本发明建立了一种新型的结合了金霉素显色反应和高通量筛选的方法。本发明研究了金霉素5种能够生长并可以检测到金霉素的平板培养基的生长和产抗量情况，得到了最佳平板培养及配方，有效提高了孢子生长速度，有效提高了后续筛选效率。同时，本发明通过对显色反应试剂等进行优化，得到了线性关系好的检测方法，有效提高了筛选的效率和准确性，防止了提取效果不佳导致的筛选准确性不足的问题。
具体实施方式
金霉素的测定：高效液相色谱(HPLC)
仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差折光检测器和工作站)，色谱条件：
色谱柱：ZORBAX LEclipse Lus Plus C18
流动相：28％N-N二甲基甲酰胺+2％2mol/LH3PO4+70％去离子水
流速：1mL/min
柱温：35℃
进样量：10μL
紫外检测器波长：365nm(检测金霉素)
样品制备：称取发酵液1g于试管中，用0.01mol/LHCl定容至50mL，超声5min，0.22μL无机系滤膜过滤后，进行高效液相色谱分析。
致死率的计算：
其中A表示空白对照平板上的菌落形成单位个数，B表示经过诱变处理后平板上的菌落形成单位个数。
培养基：
固体平板培养基1号(g/L)：蔗糖20g，进口酵母粉0.5g，KH2PO40.8g，琼脂18g。
固体平板培养基2号(g/L)：可溶性淀粉20g，进口酵母粉0.5g，KH2PO40.8g，琼脂18g。
固体平板培养基3号(g/L)：葡萄糖20g，进口酵母粉0.5g，KH2PO40.8g，琼脂18g。
固体平板培养基4号(g/L)：甘油20g，进口酵母粉0.5g，KH2PO40.8g，琼脂18g。
固体平板培养基5号(g/L)：面粉20g，进口酵母粉0.5g，KH2PO40.8g，琼脂18g。
种子培养基(g/L)：蔗糖30g，进口酵母粉5g，MgSO40.5g，(NH4)2SO43g，NaCl 4g，KH2PO41g，CaCO30.2g。
孔板发酵培养基(g/L)：蔗糖30g，MgSO40.5g，CaCO30.33g，柠檬酸2.55g，(NH4)2SO43g，1mL混合液(0.3％CuSO4·5H2O、0.5％ZnSO4·7H2O、0.25％MnSO4`4H2O)。
实施例1：最佳平板培养基选择
配制五中不同配方的斜平板培养基，将稀释后的无菌金色链霉菌菌悬液涂布于固体斜面培养基上。观察金色链霉菌在平板培养基上的生长情况，并检测其产抗量。结果发现固体平板培养基1号上菌株能快速生长，孢子生长良好，而且平板培养基颜色不会对后续单克隆挑选仪挑菌造成干扰。其他培养基，要么菌株生长较慢，要么平板培养基颜色对于后续单克隆挑选仪挑菌造成干扰。
实施例2：ARTP诱变
出发菌株斜面菌种在34℃培养4-6d，刮取适量孢子于带玻璃珠的装有2mL生理盐水的试管中打散，取10μL于已经灭菌的特制载片上，放到ARTP诱变仪的载物台上，调整功率10-100w，分别照射0、10、20、30、40、50、60s，将照射后的载片用镊子夹取到装有生理盐水的EP管中，在震荡器上充分震荡后，梯度稀释。吸取100μL稀释液均匀涂布于平板上。34℃恒温培养箱中培养4d后，计数每块平板上的菌落形成单位个数，再计算出每个诱变处理时间的致死率。在入射功率为10-100W，氦气流量为1-10SLM条件下，0-25s照射时间作为最佳的诱变处理时间，致死率为80％-100％左右，有利于正突变株的产生。
实施例3：金霉素显色反应
根据金霉素与钐离子的显色反应作为初筛方法。金霉素与钐离子在近中性条件下形成浅黄色配合物，在405nm处有最大光吸收。考虑发酵结束后，培养基中含带有颜色的原料对测定结果产生一定影响。用生产发酵液配方，同时在孔板中培养与未培养菌体。结果表明，未培养菌体发酵液也有一定的OD值，说明发酵液本身的颜色对OD值得测定确实存在影响，但培养菌体的发酵液OD值大于未培养菌体的发酵液，因此发酵液本身颜色对筛选金霉素高产菌株影响小。配置浓度在0.5～20mg/L的金霉素标准品溶液，依次吸取40μL Tris-HCl缓冲溶液，60μL Sm(NO)3溶液，100μL各浓度标准品溶液震荡混匀，8min后显色完全，酶标仪测定各浓度的OD405值。确定OD405与金霉素浓度C(mg/L)的回归方程：y＝0.0112x-0.009，R2＝0.99905，其中x为样品浓度(μg/mL)，y为OD405nm，标准品浓度范围为0～20mg/L。
实施例4：高产菌株的筛选
将ARTP诱变处理后的菌悬液稀释成合适的浓度，吸取100μL的菌悬液均匀涂布在平板上，于34℃恒温培养箱中培养4d，利用QPix 420仪器或类似菌落挑选设备或手工挑取平板上诱变单菌落于96浅孔板(装有种子培养液180μL)中，在750r/min、31℃的孔板摇床上培养24h。以8％(v/v)的接种量，将96孔板中的种子液平行转接至48孔板(装有发酵培养液1000μL)中，750r/min，30℃发酵培养96h。剩余96孔板中的种子液用40％甘油保存于4℃冰箱。
发酵结束后，离心取菌体，吸取上清液稀释至金霉素浓度为0～20mg/L，然后取稀释液100μL添加到提前加入40μL Tris-HCl缓冲溶液(pH为6.7)和60μL Sm(NO)3溶液(浓度为5×10-4mol/L)的96孔板中，震荡混匀，8min后显色完全，酶标仪测定各浓度的OD405值，根据y＝0.0112x-0.009，R2＝0.99905(其中，x为金霉素浓度浓度(μg/mL)，y为OD405nm)计算得到金霉素浓度，进而根据稀释倍数换算得到发酵液的金霉素浓度，即得到产金霉素相对较高的菌株。
实施例5：筛选方法的准确性验证
将实施例4的待筛选菌株采用摇瓶培养并用HPLC方法进行检测，结果显示，实施例4方法得到的结果，与摇瓶+HPLC方法得到的结果一一对应，即实施例4得到的产金霉素相对较高的菌株也是摇瓶+HPLC方法得到的相对较高的菌株。说明，实施例4的方法准确性好、可靠性强。
另外，利用相对标准偏差(RSD)，考察初筛方法的重复性以及准确度。依据酶标仪显色法的RSD应该控制在2.0％以下。利用单菌落出发菌株高通量初筛方法重复6次平行试验，得到OD405＝0.07±0.0022，RSD＝0.144％，重复性良好。验证方法的准确度：用酶标仪检测方法检测浓度为5、10、15g/mL的标准品溶液，每个浓度检测两次，RSD分别为0.035％、0.0322％、0.057％，准确度良好。
此外，发明人还研究了提取条件对检测准确性的影响，结果发现，采用本发明的方法，能够在较短的时间内有效准确检测金霉素产量。发明人尝试了其他添加比例的发酵液、Tris-HCl缓冲溶液、Sm(NO)3溶液，结果显示不恰当的比例会使金霉素浓度与OD405nm的线性关系受到影响，会影响检测结果而最终导致部分高产菌株被筛选剔除；也曾尝试采用延长或者明显缩短显色时间等，结果发现会对OD405nm发生明显影响而导致最终检测准确性不足。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。