本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种基于数字PCR平台的miRNA检测质量控制试剂盒及其使用方法。
背景技术：
：微滴式数字PCR(DropletDigitalTMPCR)被称为第三代PCR技术，通常在人体体液例如血浆、尿液等样本中的miRNA分子丰度普遍不高，常规PCR技术在检测这类miRNA分子时存在误差较大或难以测出的问题，正由于数字PCR在微量检测技术上的重大创新和突破，目前已成为液体活检中认知度最高的技术手段。基于数字PCR平台，在人体体液例如血清或血浆miRNA检测过程中，需要经过总miRNA提取，miRNA反转录，miRNA检测三大步骤。不同于人体组织或细胞中的miRNA检测可以使用U6或RNU6B等作为内参基因，目前还没有明确定论统一可用的血清或血浆miRNA内参，并且微滴式数字PCR采用的是绝对定量的方式，检测结果显示为样品中待检测分子的具体拷贝数浓度，因此，miRNA提取效率和miRNA反转录效率对数字PCR最终的检测结果影响甚大，但目前还没有一种方便快捷的用于数字PCR平台的miRNA检测质量控制的试剂盒。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种基于数字PCR平台的miRNA检测质量控制试剂盒；本发明的第二目的在于提供基于数字PCR平台的miRNA检测质量控制试剂盒的使用方法。本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种基于数字PCR平台的miRNA检测质量控制试剂盒，其特征在于，它包括人工合成的miRNA、反转录引物、检测上引物、检测下引物和DEPC水，所述人工合成miRNA引物序列如SEQIDNo.1所示，具体为：5’-UCACCGUGUGUAGAUCAGCUUG-3’；所述反转录引物序列如SEQIDNo.2所示，具体序列为：5’-GTCGTATCCAGTGCCACACGTCCTCGAGGCTTAAGCACTGGATACGACCAAGCTGA-3’；所述检测上引物序列如SEQIDNo.3所示，具体序列为：5’-AGTGGCTCACCGTGTGTAGATC-3’；所述检测下引物序列如SEQIDNo.4所示，具体序列为：5’-GTATCCAGTGCCACACGTCCT-3’。进一步地，所述人工合成的miRNA浓度为3×106copies/μl，所述反转录引物的浓度为5μM，所述检测上引物和检测下引物的浓度为10μM，所述DEPC水的质量百分比浓度为1％。进一步地，所述人工合成的miRNA体积为8μl，所述反转录引物、检测上引物和检测下引物的体积各为1μl，所述DEPC水的体积为1ml。一种基于数字PCR平台的miRNA检测质量控制试剂盒的使用方法，它包括以下步骤：S1.用DEPC水稀释人工合成的miRNA至原浓度的1/10倍；S2.提取生物体体液的总miRNA为样品，加入裂解液类buffer裂解样品中RNA酶后，样品中加入4μl稀释后的人工合成的miRNA；S3.设定提取样品中总miRNA最终溶解体积为A，配制对照样品，具体步骤为：吸取4μl稀释后的人工合成的miRNA溶于A-4μl体积的DEPC水中；S4.在反转录样品中待检测靶miRNA同时，单独将样品和对照样品进行反转录人工合成的miRNA，每10μL反应体系中加入1μl反转录引物；S5.在数字PCR检测样品中待检测靶miRNA同时，单独对样品和对照样品进行数字PCR染色法检测人工合成的miRNA，反应体系中每20μl加入检测上引物和检测下引物各0.5μl；S6.设定数字PCR检测样品最终结果为Xcopies/μl，对照样品最终结果为Ycopies/μl，按下述结果进行判断：A.X/Y＝0.8～1，表示本次实验检测的靶miRNA结果真实可靠；B.X/Y＜0.8，表示本次实验检测的靶miRNA结果误差大，重新提取miRNA；C.X/Y＞1，表示对照样品配制存在问题，重新配制后实验。进一步地，步骤S3中所述A为10～60μl。本发明具有以下优点：本发明试剂盒提供的人工合成miRNA序列在人体中绝对不存在类似序列，避免了可能出现的PCR假阳性扩增，不但可作为数字PCR检测的外源性内参miRNA用于质量控制，且由于miRNA分子自身结构稳定、不易降解的特点有利于其长期稳定保存。此外，本试剂盒提供的反转录茎环引物和检测引物在数字PCR平台检测时均验证可得到稳定可靠的检测结果。本发明试剂盒的使用方法操作简单、使用方便，适用于大批量检测。附图说明图1为miRNA-122数字PCR检测结果；图2为人工合成miRNA数字PCR检测结果。具体实施方式下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述。实施例1：一种基于数字PCR平台的miRNA检测质量控制试剂盒，它包括人工合成的miRNA、反转录引物、检测上引物、检测下引物和DEPC水，所述人工合成miRNA引物序列如SEQIDNo.1所示，所述反转录引物序列如SEQIDNo.2所示，所述检测上引物序列如SEQIDNo.3所示，所述检测下引物序列如SEQIDNo.4所示；所述人工合成的miRNA浓度为3×106copies/μl，体积为8μl，所述反转录引物的浓度为5μM，体积为1μl；所述检测上引物和检测下引物的浓度为10μM，体积各为1μl；所述DEPC水的质量百分比浓度为1％，体积为1ml。实施例2：一种基于数字PCR平台的miRNA检测质量控制试剂盒的使用方法，它包括以下步骤：S1.用DEPC水稀释人工合成的miRNA至原浓度的1/10倍；S2.提取生物体体液的总miRNA为样品，加入裂解液类buffer裂解样品中RNA酶后，样品中加入4μl稀释后的人工合成的miRNA；S3.设定提取样品中总miRNA最终溶解体积为10～60μl(体积A)，配制对照样品，具体步骤为：吸取4μl稀释后的人工合成的miRNA溶于(A-4μl)体积的DEPC水中；S4.在反转录样品中待检测靶miRNA同时，单独将样品和对照样品进行反转录人工合成的miRNA，每10μL反应体系中加入1μl反转录引物；S5.在数字PCR检测样品中待检测靶miRNA同时，单独对样品和对照样品进行数字PCR染色法检测人工合成的miRNA，反应体系中每20μl加入检测上引物和检测下引物各0.5μl；S6.设定数字PCR检测样品最终结果为Xcopies/μl，对照样品最终结果为Ycopies/μl，按下述结果进行判断：A.X/Y＝0.8～1，表示本次实验检测的靶miRNA结果真实可靠；B.X/Y＜0.8，表示本次实验检测的靶miRNA结果误差大，重新提取miRNA；C.X/Y＞1，表示对照样品配制存在问题，重新配制后实验。实施例3：基于数字PCR平台检测健康人血浆中的miRNA-122的表达水平过程中的质量控制1、样本采集及处理使用Streck的Cell-FreeDNABCTTM管采集健康人血液一份共5ml。将血液转移至新的15ml离心管中，4℃2000g离心10min，吸取上层血浆至一新的15ml离心管中。再将血浆4℃4000g离心20min，吸取上层血浆至一新的15ml离心管中。吸取200μL血浆于一新的1.5mlEP管中，使用QIAGEN的miRNeasySerum/PlasmaKit进行总RNA的提取。其中，在加入QIAzolLysisReagent静置5min后，加入本试剂盒的4μL按10倍稀释后的人工合成miRNA(后简称Skm-QCmiR)，后续试验操作按照操作说明书进行，最终溶解体积为40μL。然后配制对照样品(图中简称Skm-QCmiR-C)，吸取4μL的稀释后的Skm-QCmiR溶于36μL体积的DEPC水中。同一份血浆共提取三次，每次均200μL，由不同的三个实验人员分别进行操作(图中简称样品1、样品2、样品3)，紫外分光光度计测定浓度均在40～50ng/μL。2、反转录miRNA-122和Skm-QCmiR将健康人样品反转录miRNA-122和Skm-QCmiR，对照样品反转录Skm-QCmiR。使用ABI公司的MicroRNAReverseTranscriptionKit进行实验操作，miRNA-122的反转录引物和探针使用TaqManTMMicroRNAAssays试剂盒(货号：002245)，反转录加样体系参照说明书进行，其中TotalRNASample加样1μL，Skm-QCmiR的反转录引物使用本发明试剂盒，反应加样体系如表1所示：表1：成分体积100mMdNTPs(withdTTP)0.15μLMultiScribeTMReverseTranscriptase,50U/μL1μL10XRTBuffer1.5μLRNaseInhibitor0.188μLNucleaseFreeWater9.662μL本发明试剂盒反转录引物1.5μL健康人TotalRNASample或Skm-QCmiR-C1μLTotal15μLmiRNA-122和Skm-QCmiR的反转录反应条件均按反转录试剂盒说明书上进行操作。3、数字PCR检测miRNA-122和Skm-QCmiR将健康人反转录后的样品进行miRNA-122和Skm-QCmiR的检测，对照样品进行Skm-QCmiR的检测。使用Bio-rad公司的QX200TMDropletDigitalTMPCR仪器平台和相配套的ddPCRTMSupermix、DropletGenerationOil、DG8TMCartridges、DG8TMGaskets和ddPCRTMDropletReaderOil试剂耗材进行检测。miRNA-122的检测探针使用TaqManTMMicroRNAAssays试剂盒(货号：002245)，检测反应体系参照说明书进行加样。Skm-QCmiR的检测使用本发明试剂盒中的检测上引物和下引物，反应加样体系如表2所示：表2：成分体积QX200TMddPCRTMEvaGreenSupermix10μL本发明试剂盒检测上引物0.5μL本发明试剂盒检测下引物0.5μL健康人或Skm-QCmiR-C反转录后样品1μLNucleaseFreeWater8μLTotal20μLmiRNA-122和Skm-QCmiR的PCR反应条件如表3所示：表3：4、结果及计算miRNA-122检测结果如图1所示，每组反应最终检测的微滴数在14000～19000之间，均大于10000，表示结果有效。检测结果显示样品1的miRNA-122含量为8.8copies/μL，样品2的miRNA-122含量为8.7copies/μL，样品3的miRNA-122含量为6.9copies/μL。Skm-QCmiR检测结果如图2所示，每组反应最终检测的微滴数在12000～16000之间，均大于10000，表示数字结果有效。检测结果显示样品1的Skm-QCmiR含量为82copies/μL，样品2的Skm-QCmiR含量为84copies/μL，样品3的Skm-QCmiR含量为74copies/μL，Skm-QCmiR-C的Skm-QCmiR含量为96copies/μL。通过质量标准计算公式可知，样品1、样品2和样品3的得分分别为82/96＝0.854，84/96＝0.875，74/96＝0.771，因此本次实验样品1、样品2检测的miRNA-122结果真实可信，误差较小，而样品3检测的miRNA-122结果可能存在检测误差较大情况。上述实施例中人工合成的miRNA简称为Skm-QCmiR，对照样品简称为Skm-QCmiR-C。SEQUENCELISTING<110>成都仕康美生物科技有限公司<120>一种基于数字PCR平台的miRNA检测质量控制试剂盒及其使用方法<130>2016<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>22<212>RNA<213>人工序列<400>1ucaccguguguagaucagcuug22<210>2<211>56<212>DNA<213>人工序列<400>2gtcgtatccagtgccacacgtcctcgaggcttaagcactggatacgaccaagctga56<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>3agtggctcaccgtgtgtagatc22<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4gtatccagtgccacacgtcct21当前第1页1 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