通过冷冻干燥与硫醇‑烯点击化学制备的半胱氨酸透明质酸结合物及其合成方法和应用与流程

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通过冷冻干燥与硫醇‑烯点击化学制备的半胱氨酸透明质酸结合物及其合成方法和应用与流程

本发明涉及一种冷冻干燥与硫醇-烯点击修饰形成的半胱氨酸功能化透明质酸结合物及其合成方法,以及其制备可注射原位形成水凝胶的应用,属于生物医药领域。



背景技术:

生物支架材料是组织工程和再生医学研究的关键。因为,支架材料不仅为细胞提供结构支撑作用,而且还起到模板作用,用于引导组织再生和控制组织结构。其中,水凝胶类的生物支架在组织工程和再生医学应用中尤为广泛。

水凝胶是亲水的聚合物网络,能够吸收大量的水分,具有良好的生物相容性。虽然水凝胶在生物医药中的应用取得了巨大的进展,然而,发展满足临床需要:在温和条件下不使用有毒试剂可注射原位形成的共价交联的水凝胶仍然面临着挑战。大部分水凝胶在组织工程方面的应用的主要缺陷就是需要外科手术介导,手术过程的复杂繁琐无疑给患者带来很大的痛苦和风险。因此,可注射水凝胶的研究引起人们注意,其具有显著的优势:水凝胶在体内原位形成,不经过外科手术而通过针管注射,以最小程度地对机体组织侵入,不仅起到治疗作用,而且还可以与各种生长因子、药物混合填充组织任意形状的缺损,达到更好的治疗效果,这样就可避免外科手术过程中的高度创伤性,特别当用于修复复杂形状的组织时,可注射水凝胶具有自适应性。

硫醇-烯点击化学的合成机理主要是指硫醇-烯自由基加成(见附图1)(Kade M J,Burke D J,Hawker C J.The power of thiol-ene chemistry[J].Journal of Polymer Science Part A Polymer Chemistry,2010,48(4):743-750.)。在烯存在的条件下,通过热或者光的引发下使含巯基的分子氢脱去从而获得含硫的自由基,该自由基和碳碳双键(C=C)通过反马氏(anti-Markovnikov)加成形成以碳为中心的活性自由基,与另一含巯基的分子发生链转移反应得到加成产物和另一活性自由基。因此,利用硫醇-烯点击化学反应具有简单、高效、可靠、选择性的C-S成键、特别是可在水溶液中进行的优点修饰多糖类化合物具有显著的优越性。

氧酯介导自然化学连接(oxo-ester mediated native chemical ligation,OMNCL)是自然化学连接(native chemical ligation)概念的扩展。人们发现,酯类化合物和N-末端半光氨酸的化合物在生理条件下(磷酸盐缓冲溶液,pH 7-9)混合后,半胱氨酸的巯基和酯类化合物的醇发生交换,形成一个五圆环的中间体后自发地重排,产生一个新的酰胺键。这个化学反应称之为氧酯介导自然化学连(oxo-ester mediated native chemical ligation,OMNCL,见附图2)。OMNCL有几个明显的优点:①具有化学选择性,酯类只与半胱氨酸、或N-末端半胱氨酸的化合物反应形成新的酰胺键,不受其他硫醇和巯基存在的干扰;②在温和的条件下,不使用催化剂、引发剂等可能有毒的化合物而高效反应;③与其它使用巯基的化学连接反应形成的水凝胶不同,自然化学连接反应在形成新的酰胺键的同时,还在骨架上产生一个巯基基团。这个巯基不仅可以根据不同目的用来进一步在骨架上功能化水凝胶,而且,巯基化(硫醇化)的聚合物具有更好的生物黏附性。④另外,酯类结构中的醇在OMNCL反应时释放到溶液中,那么,在设计酯的时候,有可能把这个醇设计为羟基化的药物和细胞生长因子的前体,从而在水凝胶形成的同时,释放这些药物和生长因子到水凝胶中。因此,利用OMNCL反应的特点和优点得到的可注射原位形成的共价交联的水凝胶具有显著的优越性。例如:已有文献以聚乙二醇为主体,末端酯或半胱氨酸功能化,通过氧酯介导自然化学连接反应得到聚乙二醇水凝胶(Strehin I,Gourevitch D,Zhang Y,et al.Hydrogels Formed by Oxo-ester Mediated Native Chemical Ligation.[J].Biomaterials Science,2013,1(6):603-613.)。

透明质酸(hyaluronic acid,HA)广泛分布于动物的各种组织中,由N-乙酰-D-葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸双糖重复单位组成,被应用于组织工程与再生医学中(Allison D D,Grandeallen K J.Review.Hyaluronan:a powerful tissue engineering tool.[J]Tissue Engineering,2006,12(8):2131-40.)。例如20世纪80年代中期HA已被应用于医学美容创伤敷料以及作为关节炎治疗药上市在细胞外基质中,透明质酸是细胞表面受体CD44的配体,而CD44受体参与多种细胞过程,比如细胞黏附、细胞迁移和增值。由于其重要的生理作用,机体或创面直接注射透明质酸后可明显减轻并消除组织的炎症反应,促进创面与伤口愈合。但是,由于透明质酸在体内被透明质酸酶快速地清除,体内停留时间短、机械强度低等不足,这样的缓解作用也是短暂的,所以透明质酸共价改性形成可注射原位共价交联的透明质酸水凝胶就显示出了它的优越性。

透明质酸主要化学修饰靶点包括:D-葡萄糖醛酸的羧基、N-乙酰-D-葡萄糖胺的羟基、以及N-乙酰-D-葡萄糖胺的N-乙酰基。目前临床使用的HA衍生物多为对其羧酸和羟基修饰而成,通过酯化(Esterification)、酰胺化(Amidation)、开环(Ring Opening)、交联(Cross-linking)、接枝(Graft)等各种化学改性方法,制备出功能化HA衍生物。其中对透明质酸的羧基修饰的研究比较多,例如有文献通过己二酸二酸腆修饰,并且加入EDC与HOBt作为耦合剂与催化剂,修饰透明质酸的羧基,得到透明质酸结合物,再通过交联形成透明质酸水凝胶(Yeo Y,Highley C B,Bellas E,et al.In situ,cross-linkable hyaluronic acid hydrogels prevent post-operative abdominal adhesions in a rabbit model[J].Biomaterials,2006,27(27):4698-705.)。也有通过与透明质酸的羟基反应形成水凝胶的交联化学反应,比如Seidlits分别采用甲基丙烯酸酐和4-戊烯酸酐对透明质酸C-6位伯醇羟基进行酯化修饰,最后在紫外光照条件下发生交联反应,得到水凝胶(Seidlits SK,Khaing ZZ,Petersen RR,et al.The Effects of Hyaluronic Acid Hydrogels with Tunable Mechanical Properties on Neural Progenitor Cell Differentiation[J].Biomaterials,2010,31(14):3930-3940.)。还有先用半胱氨酸改性缩水甘油醚和透明质酸的羟基反应,再进行自然化学反应形成水凝胶(Zhang X,Sun P,Huangshan L,et al.Improved method for synthesis of cysteine modified hyaluronic acid for in-situ hydrogel formation[J].Chemical Communications,2015,51(47):9662-5.)。还有如中国专利CN 103910886A,其以透明质酸为主体,采用半胱氨酸单边修饰后的聚乙二醇类化合物与透明质酸羟基进行开环反应形成醚键,在与多分枝聚乙二醇衍生物结合通过自然化学连接形成可注射原位形成的透明质酸水凝胶。

透明质酸经过交联后形成的水凝胶应该是比较理想的生物支架材料。它克服了天然透明质酸体内快速地被清除,机械强度低等不足。但是,通过透明质酸的羧基制备的交联的水凝胶,可能会产生一些副反应。有研究表明若其羧基被化学修饰,则会导致透明质酸的负电荷减少,从而造成CD44受体不能正常识别。细胞CD44受体据认为是通过透明质酸的负电荷与透明质酸作用(Morra M.Engineering of biomaterials surfaces by hyaluronan.[J].Biomacromolecules,2005,6(3):1205-1223.),而减少透明质酸的负电荷则会影响细胞CD44受体与透明质酸的作用,从而会降低细胞修复损伤的能力(Herrera M B,Bussolati B,Bruno S,et al.Exogenous mesenchymal stem cells localize to the kidney by means of CD44 following acute tubular injury[J].Kidney International,2007,72(4):430-441.),所以透明质酸就失去了其作为生物材料的优越性。而通过其羟基反应得到透明质酸水凝胶往往需要通过紫外光照反应或是用其他方法已经预先形成的水凝胶,这样就不能实现原位注射。因此,本发明以透明质酸为原料,通过冷冻干燥与硫醇-烯点击化学修饰透明质酸N-乙酰-D-葡萄糖胺的羟基,不改变其羧基所带负电荷,得到具有稳定醚键产物,再通过氧酯介导自然化学连接反应得到可注射原位共价交联透明质酸水凝胶具有显著地优越性。



技术实现要素:

本发明的第一个目的在于提供一种通过冷冻干燥与硫醇-烯点击化学制备的半胱氨酸功能化透明质酸结合物。本发明的第二个目的在于提供一种通过冷冻干燥与硫醇-烯点击化学制备的半胱氨酸功能化透明质酸结合物的合成方法。本发明的第三个目的在于提供通过冷冻干燥与硫醇-烯点击化学制备的半胱氨酸功能化透明质酸结合物在制备可注射原位形成性的共价交联透明质酸水凝胶的方法。本发明的第四个目的在于提供可注射原位形成性的共价交联透明质酸水凝胶作为细胞支架材料在胰岛细胞培养与胰岛素分泌中的应用。

本发明的技术方案如下:

一种通过冷冻干燥与硫醇-烯点击化学制备的半胱氨酸功能化透明质酸结合物,结构式为:

式中n=200-4000。

所述一种通过冷冻干燥与硫醇-烯点击化学制备的半胱氨酸功能化透明质酸结合物的制备方法,包括以下步骤:

1)取结构式为的化合物1透明质酸与结构式为的化合物2,通过冷冻干燥的方法形成结构式为的化合物3;

2)取结构式为的化合物4和结构式为的化合物5形成结构式为的化合物6;

3)化合物6与二硫键还原剂发生还原反应形成结构式为的化合物7;

4)取化合物3与化合物7,在光引化剂和紫外光照射下发生硫醇-烯点击化学形成结构式为的化合物8;

5)分别脱去化合物8上的叔丁氧羰基和乙酰氨甲基保护基,得到结构式为的化合物9,即透明质酸结合物产物。

步骤1)中,化合物1透明质酸的分子量为8~160万。

步骤1)中,化合物3其修饰率范围为4.03~64.11%;步骤4)中,化合物8其修饰率的范围为2.33~45.67%。

一种通过冷冻干燥与硫醇-烯点击化学制备的半胱氨酸功能化透明质酸结合物在制备可注射原位形成的水凝胶的应用。

所述的可注射原位水凝胶是由所述的通过冷冻干燥与硫醇-烯点击化学制备的半胱氨酸功能化透明质酸结合物,与聚乙二醇结合物通过氧酯介导自然化学连接反应生成。

所述的可注射原位水凝胶的制备方法,包括以下步骤:

1)用所述的透明质酸结合物与磷酸盐缓冲液配成溶液;

2)用聚乙二醇氧酯与磷酸盐缓冲液配成溶液;

3)把两种溶液混合,通过自然化学连接反应,制备可注射原位形成的水凝胶。

所述的聚乙二醇氧酯其结构式为式中n=50~500,m=2~8。

所述的可注射原位水凝胶的制备方法,步骤1)和2)中,磷酸盐缓冲液的pH为7.0~7.6,所配成的溶液浓度为1~20%;步骤3)中,透明质酸结合物与聚乙二醇氧酯的摩尔比1∶(0.1~1),水凝胶形成的时间范围为5~8000秒。

所述的一种通过冷冻干燥与硫醇-烯点击化学制备的半胱氨酸功能化透明质酸结合物制备的可注射原位形成的水凝胶在培养胰岛细胞和胰岛素分泌的应用。

本发明的有益效果是:首次通过冷冻干燥和硫醇-烯点击化学修饰得到半胱氨酸功能化透明质酸结合物,其巯基基团能与巯基反应基团发生化学反应,可进一步修饰功能化;首次发现了在温和的条件下(冷冻干燥)根据不同的需求制备不同修饰率(2.33~45.67%)的功能化透明质酸结合物的方法;此法应该可以用于其他多糖的结构修饰和功能化;不同修饰率的半胱氨酸功能化透明质酸结合物与聚乙二醇结合物通过氧酯介导自然化学连接制备了可注射原位形成的水凝胶,具有良好的流变学性质;这类水凝胶具有游离的巯基,能增加生物材料的细胞黏附性,可作为细胞支架材料在胰岛细胞培养及刺激胰岛素分泌应用,具有广阔的生物医药前景。

具体如下:

本发明首次采用冷冻干燥的方法对透明质酸N-乙酰-D-葡萄糖胺的羟基进行烯丙基缩水甘油醚功能化修饰,得到不同修饰率烯丙基透明质酸衍生物,其修饰率比在常温下溶液中的反应修饰率显著提高(35.67%vs 3.3%);此项技术延伸用于热不稳定的生物活性分子如酶、抗体、蛋白类生长因子等的高分子聚合物修饰比如聚乙二醇化,会有无可比拟的优势;运用硫醇-烯点击化学对烯丙基透明质酸衍生物进行系列半胱氨酸功能化修饰,得到不同修饰率半胱氨酸透明质酸结合物。此路线为不同于其他透明质酸功能化方法,是一种新的创新合成路线,并且第一次使用在多糖的修饰化学中,为透明质酸的结构修饰以及其他多糖的修饰修饰提供了新的方法。

合成得到的半胱氨酸透明质酸结合物与四分枝聚乙二醇氧酯,通过氧酯介导自然化学连接形成具有活性巯基的水凝胶,增加了透明质酸的黏附性,并可于细胞培养,也可进一步进行功能化修饰,比如与药物结合,起到药物缓控释的作用,另外,酯结构中的醇在OMNCL反应时会释放到溶液中,在设计酯的时候,可以把这个醇设计为羟基化的药物或细胞生长因子的前体,从而在水凝胶形成的同时,释放这些药物或生长因子到水凝胶中,增加了透明质酸在生物医药领域的应用。

本发明将通过化学修饰得到的一系列半胱氨酸透明质酸结合物应用于水凝胶的形成中,通过氧酯介导自然化学连接得到具有可控性、可注射原位形成性的共价交联透明质酸水凝胶。通过对比水凝胶的流变学性能、作为生物支架材料在胰岛细胞培养和胰岛素分泌实验结果,探究透明质酸最佳的修饰条件。作为生物支架材料可以运用在细胞培养领域,水凝胶的形成可通过针管注射以最小损伤对机体侵入,而不是传统意义上通过外科手术、可用于填补任意机体形状的缺损,同时还可包裹药物或细胞因子,为临床医学和组织工程等领域提供理想的生物材料。

因此,本发明以透明质酸为原料,通过冷冻干燥与硫醇-烯点击化学修饰其N-乙酰-D-葡萄糖胺的羟基,而不影响其本身负电荷,最后通过氧酯介导自然化学连接与聚乙二醇类化合物反应可注射原位形成共价交联的透明质酸水凝胶,并且形成的水凝胶具有良好生物相容性。本发明具有突出的实质性特点,对所属技术领域的技术人员来说,发明相对于现有技术是非显而易见的。

附图说明

图1是硫醇-烯点击化学机理图;

图2是氧酯介导自然化学连接反应机理图;

图3是化合物6核磁共振氢谱图;

图4是化合物7核磁共振氢谱图;

图5是实施例1中合成的化合物3(编号1)的核磁共振氢谱图;

图6是实施例1中合成的化合物3(编号2)的核磁共振氢谱图;

图7是实施例1中合成的化合物3(编号3)的核磁共振氢谱图;

图8是实施例1中合成的化合物3(编号4)的核磁共振氢谱图;

图9是实施例1中合成的化合物3(编号5)的核磁共振氢谱图;

图10是实施例1中合成的化合物3(编号6)的核磁共振氢谱图;

图11是实施例1中合成的化合物3(编号7)的核磁共振氢谱图;

图12是透明质酸原料(化合物1)核磁共振氢谱图;

图13是实施例1中合成的化合物8(编号1)的核磁共振氢谱图;

图14是实施例1中合成的化合物8(编号2)的核磁共振氢谱图;

图15是实施例1中合成的化合物8(编号3)的核磁共振氢谱图;

图16是实施例1中合成的化合物8(编号4)的核磁共振氢谱图;

图17是实施例1中合成的化合物8(编号5)的核磁共振氢谱图;

图18是实施例1中合成的化合物8(编号6)的核磁共振氢谱图;

图19是实施例1中合成的化合物8(编号7)的核磁共振氢谱图;

图20是烯丙基缩水甘油醚透明质酸修饰率(◆)和Boc-Cys(Acm)-半胱胺巯基透明质酸修饰率(▲)图;

图21是右旋糖酐标准GPC校准曲线图;

图22是Cys-HA1的GPC色谱图;

图23是Cys-HA2的GPC色谱图;

图24是Cys-HA3的GPC色谱图;

图25是Cys-HA4的GPC色谱图;

图26是Cys-HA5的GPC色谱图;

图27是Cys-HA6的GPC色谱图;

图28是Cys-HA7的GPC色谱图;

图29是HA(100kDa)的GPC色谱图;

图30是Cys-HA1与4-ARM-PEG-S-S形成的水凝胶的流变学时间扫描图;

图31是Cys-HA1与4-ARM-PEG-S-S形成的水凝胶的流变学频率扫描图;

图32是Cys-HA1与4-ARM-PEG-S-S形成的水凝胶的流变学应力扫描图;

图33是Cys-HA2与4-ARM-PEG-S-S形成的水凝胶的流变学时间扫描图;

图34是Cys-HA2与4-ARM-PEG-S-S形成的水凝胶的流变学频率扫描图;

图35是Cys-HA2与4-ARM-PEG-S-S形成的水凝胶的流变学应力扫描图;

图36是Cys-HA3与4-ARM-PEG-S-S形成的水凝胶的流变学时间扫描图;

图37是Cys-HA3与4-ARM-PEG-S-S形成的水凝胶的流变学频率扫描图;

图38是Cys-HA3与4-ARM-PEG-S-S形成的水凝胶的流变学应力扫描图;

图39是Cys-HA4与4-ARM-PEG-S-S形成的水凝胶的流变学时间扫描图;

图40是Cys-HA4与4-ARM-PEG-S-S形成的水凝胶的流变学频率扫描图;

图41是Cys-HA4与4-ARM-PEG-S-S形成的水凝胶的流变学应力扫描图;

图42是Cys-HA5与4-ARM-PEG-S-S形成的水凝胶的流变学时间扫描图;

图43是Cys-HA5与4-ARM-PEG-S-S形成的水凝胶的流变学频率扫描图;

图44是Cys-HA5与4-ARM-PEG-S-S形成的水凝胶的流变学应力扫描图;

图45是Cys-HA6与4-ARM-PEG-S-S形成的水凝胶的流变学时间扫描图;

图46是Cys-HA6与4-ARM-PEG-S-S形成的水凝胶的流变学频率扫描图;

图47是Cys-HA6与4-ARM-PEG-S-S形成的水凝胶的流变学应力扫描图;

图48是Cys-HA7与4-ARM-PEG-S-S形成的水凝胶的流变学时间扫描图;

图49是Cys-HA7与4-ARM-PEG-S-S形成的水凝胶的流变学频率扫描图;

图50是Cys-HA7与4-ARM-PEG-S-S形成的水凝胶的流变学应力扫描图;

图51是5%编号8的Cys-HA的对照流变学时间扫描图;

图52是不同修饰率Cys-HA与4-ARM-PEG-S-S交联形成水凝胶的时间图;

图53是形成的透明质酸水凝胶样图;

图54是不同修饰率Cys-HA与4-ARM-PEG-S-S交联水凝胶及添加活性多肽的RIN m5f CCK实验图;

图55是HA水凝胶培养RIN m5f细胞荧光图(1当量);

图56是添加1%GRGDSPG的HA水凝胶培养RIN m5f细胞荧光图(1当量);

图57是添加1%Exenatide的HA水凝胶培养RIN m5f细胞荧光图(1当量);

图58是添加1%Exenatide+1%GRGDSPG的HA水凝胶培养RIN m5f细胞荧光图(1当量);

图59是胰岛素分泌标准曲线图;

图60是3.3mmol/l葡糖糖刺激RIN m5f细胞胰岛素分泌图;

图61是16.7mmol/l葡糖糖刺激RIN m5f细胞胰岛素分泌图。

具体实施方式

一种通过冷冻干燥与硫醇-烯点击化学制备的半胱氨酸功能化透明质酸结合物,结构式为:

式中n=200-4000。

硫醇-烯点击化学制备的半胱氨酸功能化透明质酸结合物其合成路线如下:

所述一种通过冷冻干燥与硫醇-烯点击化学制备的半胱氨酸功能化透明质酸结合物的制备方法,包括以下步骤:

1)取结构式为的化合物1透明质酸与结构式为的化合物2,通过冷冻干燥的方法形成结构式为的化合物3;

2)取结构式为的化合物4和结构式为的化合物5形成结构式为的化合物6;

3)化合物6与二硫键还原剂发生还原反应形成结构式为的化合物7;

4)取化合物3与化合物7,在光引化剂和紫外光照射下发生硫醇-烯点击化学形成结构式为的化合物8;

5)分别脱去化合物8上的叔丁氧羰基和乙酰氨甲基保护基,得到结构式为的化合物9,即透明质酸结合物产物。

优选的,步骤1)中,化合物1透明质酸的分子量为8~160万。

优选的,步骤1)中,化合物3其修饰率范围为4.03~64.11%;步骤4)中,化合物8其修饰率的范围为2.33~45.67%。

一种通过冷冻干燥与硫醇-烯点击化学制备的半胱氨酸功能化透明质酸结合物在制备可注射原位形成的水凝胶的应用。

所述的可注射原位水凝胶是由所述的通过冷冻干燥与硫醇-烯点击化学制备的半胱氨酸功能化透明质酸结合物,与聚乙二醇结合物通过氧酯介导自然化学连接反应生成。

所述的可注射原位水凝胶的制备方法,包括以下步骤:

1)用所述的透明质酸结合物与磷酸盐缓冲液配成溶液;

2)用聚乙二醇氧酯与磷酸盐缓冲液配成溶液;

3)把两种溶液混合,通过自然化学连接反应,制备可注射原位形成的水凝胶。

优选的,所述的聚乙二醇氧酯其结构式为式中n=50~500,m=2~8。

优选的,所述的可注射原位水凝胶的制备方法,步骤1)和2)中,磷酸盐缓冲液的pH为7.0~7.6,所配成的溶液浓度为1~20%;步骤3)中,透明质酸结合物与聚乙二醇氧酯的摩尔比1∶(0.1~1),水凝胶形成的时间范围为5~8000秒。

所述的一种通过冷冻干燥与硫醇-烯点击化学制备的半胱氨酸功能化透明质酸结合物制备的可注射原位形成的水凝胶在培养胰岛细胞和胰岛素分泌的应用。

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。

实施例1

1)化合物3的合成

表1化合物3的合成方案

备注:1g 10万透明质酸含有2.636mmol伯醇羟基;烯丙基缩水甘油醚分子量:114.14g/mol密度:0.962g/ml沸点:154℃(lit.)

取透明质酸(100kDa)14g,用超纯水700ml溶解于1000ml圆底烧瓶中配置成浓度为2%(w/v)的透明质酸水溶液,准备7只编号为1~7的250ml圆底烧瓶,每个烧瓶装入100ml 2%的透明质酸溶液备用,取9.76ml的烯丙基缩水甘油醚用容量瓶加入超纯水定容至100ml混合均匀,向1~7号圆底烧瓶加入对应当量体积的烯丙基缩水甘油醚水溶液,室温搅拌混合均匀,转移至培养皿中放入-80℃冷冻,冷冻干燥,得到一系列修饰率的烯丙基缩水甘油醚透明质酸结合物,并通过核磁共振检测得其修饰率。

对化合物3进行核磁共振检测,对图中信号进行分析归属,1H NMR(D2O)显示在δ5.88~5.98ppm处出现烯丙基(CH2=CH2-CH2-O-)信号,所以可判断该化合物为化合物3,通过比对δ 5.88~5.98ppm处出现出现烯丙基(CH2=CH2-CH2-O-)信号与δ1.95ppm处透明质酸中乙酰氨基中甲基(-NH-COCH3)信号比值可计算出此步反应的修饰率为4.03%~64.11%。

2)化合物6的合成

表2化合物6的合成方案

取Boc-Cys(Acm)-OH 20g(化合物4,223.28g/mol,68.41mmol)于1000ml圆底烧瓶中用DCM 300ml溶解,接着搅拌加入用DCM 200ml溶解的PyBOP 39.16g(520.40g/mol,68.41mmol x1.1eg)溶液,随后搅拌加入三乙胺19.06ml(101.19g/mol,68.41mmol x2eq),随着三乙胺的加入溶液会由浑浊变为澄清,搅拌活化10分钟,接下来缓慢滴加用DCM 200ml溶解已除去二盐酸盐的胱胺4.88ml(152.28g/mol,68.41mmol x0.55eq)。胱胺二盐酸盐参照Ivan S.Alferiev(Alferiev I S,Connolly J M,Levy R J.A novel mercapto-bisphosphonate as an efficient anticalcification agent for bioprosthetic tissues[J].Journal of Organometallic Chemistry,2005,690(10):2543-2547.)所述方法除去盐酸盐备用。胱胺滴加完毕后,反应在室温、氩气条件下搅拌反应3小时,反应过程用Silica gel 60 F254硅胶薄层色谱和酸性茚三酮检测,TLC展开剂为二氯甲烷-甲醇-乙酸(36%)(100∶6∶1),反应完成后减压浓除去溶剂至缩至小体积,用0.1mol/l盐酸水溶液酸化pH至6~7后,用DCM对其进行萃取,之后采用10mmol/1HCl,5%NaHCO3,H2O对有机层各萃取三次,最后用饱和NaCl溶液对有机层萃取一次,对萃取后的有机层用无水硫酸镁干燥2h,减压浓缩去除溶剂,得到油状物化合物6(21.58g,产率90%)用硅胶色谱柱纯化后得到白色块状固体。1H NMR(500MHz,DMSO):δ8.52(s,1H,CH3CONH-),8.02(s,1H,-CONHCH2-),6.98(d,J=8.3Hz,1H,-OCONHCH-),4.30-4.13(m,2H,-NHCH2S-),4.08(d,J=5.3Hz,1H,-OCONHCH-),3.31-3.16(m,2H,-CONHCH2-),2.74(ddd,J=58.7,13.6,9.1Hz,2H,-SCH2CH-),2.40(d,J=7.9Hz,2H,-CH2SH),1.84(s,3H,CH3CONH-),1.38(s,9H,(CH3)3OCO-)(见附图3)。

3)化合物7合成

表3化合物7的合成方案

取化合物620g(700.95g/mol,28.53mmol)于1000ml的圆底烧瓶,用乙腈400ml溶解,取9g三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP.HCl,286.65g/mol,28.53mmol x1.1eq)用50ml去离子水溶解加入上述乙腈溶液,反应在室温、氩气条件下搅拌2小时,反应过程用Silica gel 60 F254硅胶薄层层析色谱和酸性茚三酮、Ellman试剂检测,TLC展开剂为二氯甲烷-甲醇-乙酸(36%)(100∶6∶1),反应完成后减压浓除去溶剂,用0.1mol/l盐酸水溶液酸化pH至3~6后,用DCM对其进行萃取,之后采用5%NaHCO3,10mmol/l HCl,H2O对有机层各萃取三次,最后用饱和NaCl溶液对有机层进行萃取一次,减压浓缩除去溶剂得到油状物化合物7(19.05g,产率95%),用硅胶色谱柱纯化后得到油状液体。1H NMR(500MHz,DMSO):δ8.52(s,1H,CH3CONH-),8.02(s,1H,-CONHCH2-),6.98(d,J=8.3Hz,1H,-OCONHCH-),4.30-4.13(m,2H,-NHCH2S-),4.08(d,J=5.3Hz,1H,-OCONHCH-),3.31-3.16(m,2H,-CONHCH2-),2.74(ddd,J=58.7,13.6,9.1Hz,2H,-SCH2CH-),2.40(d,J=7.9Hz,2H,-CH2SH),1.84(s,3H,CH3CONH-),1.50(s,1H,-CH2SH),1.38(s,9H,(CH3)3OCO-)(见附图4)。

4)化合物8的合成

表4化合物8的合成方案

备注:化合物7(Boc-Cys(Acm)-半胱胺-SH)分子量:351.13g/mol:安息香二甲醚(DMPA)分子量:256.30g/mol。

化合物8的合成是参照硫醇-烯点击化学进行(Killops K L,Campos L M,Hawker C J.Robust,Efficient,and Orthogonal Synthesis of Dendrimers via Thiol-ene“Click”Chemistry[J].Journal of the American Chemical Society,2008,130(15):5062-4.)。取上述七种不同修饰率的烯丙基缩水甘油醚透明质酸(化合物3)各2g用超纯水配置成浓度为2%(w/v)的透明质酸水溶液,准备7只编号为1~7号的250ml带盖石英烧杯,每个烧瓶装入对应修饰率烯丙基缩水甘油醚透明质酸备用,取化合物737.55g用78ml乙腈溶解,向1~7号石英烧杯加入对应当量数和体积数的化合物7乙腈溶液,室温搅拌混合均匀,取安息香二甲醚4.22g用39ml乙腈溶解,向上述1~7号石英烧杯加入对应当量数和体积数安息香二甲醚(DMPA)乙腈溶液,室温搅拌混合均匀后,在紫外光UV λ365nm照射下24h后,核磁氢谱中烯基信号消失,提示硫醇-烯点击化学完全。反应完全后进行减压浓缩除去有机溶剂,再用分子量为10kDa的透析袋进行透析除去小分子,透析液为50%(v/v)乙醇水溶液,透析处理48h每6h更换一次透析液,最后一次透析采用超纯水透析6h,透析期间用Silica gel 60 F254硅胶薄层色谱板、酸性茚三酮和Ellman试剂进行检查是否透析完毕,透析完成后进行冷冻干燥处理得一系列化合物8。再通过核磁共振检测其修饰率。

对化合物8进行核磁共振检测,对图中信号进行分析归属,1H NMR(D2O)显示在δ1.37ppm处出现叔丁氧羰基(Boc)信号,所以可判断该化合物为化合物8,通过比对δ1.37ppm处出现叔丁氧羰基(Boc)信号与δ1.95ppm处透明质酸中乙酰氨基中甲基(-NH-COCH3)信号比值可计算出此步反应的修饰率约2.33%~45.67%。

5)化合物9的合成

表5中间体8a的合成方案

a.脱Boc保护基取上述七种不同修饰率化合物8各2g编号为1~7,每个样品加入20ml三氟乙酸使其溶解,在室温搅拌的条件下搅拌反应2h后,溶液进行减压浓缩干燥得中间体8a。

表6化合物9的合成方案

备注:2Na2S2O3+I2=Na2S4O6+2NaI

b.脱Acm保护基对经过三氟乙酸脱Boc保护基处理后得到的中间体8a的1~7号样品装入250ml的圆底烧瓶中,用1%NaOH调节pH至中性,取单质碘14.99g用168ml乙醇溶解,向1~7号250ml的圆底烧瓶加入对应当量数和体积数的碘乙醇溶液,室温搅拌反应4h,期间,发现圆底烧瓶中有褐色凝胶产生,向其中加入一定体积的巯基乙醇水溶液直到凝胶溶解,反应完成后,取硫代硫酸钠(Na2S2O3)19.61g用84ml的超纯水溶解后向上述1~7号圆底烧瓶加入对应当量数和体积的硫代硫酸钠水溶液进行中和滴定反应,除去没有反应的碘,搅拌反应2h后,进行减压浓缩除去溶剂,再用分子量为10kDa的透析袋透析除去小分子,透析液为50%(v/v)乙醇水溶液,透析处理48h每6h更换一次透析液,最后一次透析采用超纯水透析6h,透析期间用Silica gel 60F254硅胶薄层色谱板和酸性茚三酮和Ellman试剂进行检查是否透析完毕。透析完成后进行冷冻干燥,得一系列不同修饰率产物9。通过对1H NMR(D2O)图谱中信号进行分析归属,在化合物8的核磁共振氢谱的基础之上在δ1.37ppm处的叔丁氧羰基信号(Boc)消失,可判断该化合物8脱保护完全,所得到的化合物为目标产物化合物9。

实施例2

通过氧酯介导自然化学连接反应可注射原位形成的共价交联透明质酸水凝胶具体路线如下:

实验步骤:

A溶液:称取实施例1合成的一系列修饰率的半胱氨酸透明质酸结合物(Cys-HA)35mg用磷酸盐缓冲液(pH7.6)350ul溶解于1ml离心管中。

B溶液:称取35mg 10k四分支聚乙二醇氧酯结合物(4-ARM-PEG-S-S)用磷酸盐缓冲液(pH7.6)350ul溶解于1ml离心管中。

A溶液与B溶液利用旋涡混合器迅速混合均匀,加入流变仪上开始进行测试。先进行时间扫描(Time sweep),待模量曲线不再变化时进行频率扫描(Frequency sweep),最后进行应变扫描(Strain sweep),参数设置如下所述。

流变学测试中参数设置为,扫描模式:振荡;转子:PP25,PP间距(gap)1mm;数据取点频率:1/20s;测试温度:20℃。

Time sweep(时间扫描):频率(f)为1Hz,应力(Strain)为1%,恒定时间点取数据;

Frequency sweep(频率扫描):频率(f)为10~0.01Hz,应力(Strain)为1%,共取19个点,No time Setting;

Strain sweep(应力扫描):频率(f)为1Hz,应力(Strain)为0.1%~100%,共取19个点,No time Setting。

实施例3

半胱氨酸透明质酸结合物溶液与四分支聚乙二醇氧酯结合物(4-ARM-PEG-S-S)形成水凝胶方式验证.

a.称取实施例1中合成的最大修饰率的半胱氨酸透明质酸结合物(Cys-HA)35mg用磷酸盐缓冲液(pH7.6)700μl溶解于1ml离心管中,进行充足的时间扫描(Time sweep)测试,时间扫描(Time sweep)条件与实施例2中一致,无凝胶形成。结果见附图51。

b.对实施例2中,A溶液与B溶液形成的水凝胶放入足量的TCEP.HCl溶液中过夜观察,发现还是凝胶状态。

实施例4

参照实施例2,将结构式为n=50~500,m=2~8化合物10替换实施例6中B溶液里10k四分支聚乙二醇氧酯结合物(4-ARM-PEG-S-S)。

实施例5

RIN m5f细胞CCK实验

CCK实验检测原理

Cell Counting Kit简称CCK试剂盒,是一种基于WST-8(化学名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。WST-8属于MTT的升级产品,工作原理为:在电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物。颜色的深浅与细胞的增殖成正比,与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450nm波长处测定OD值,间接反映活细胞数量。

RIN m5f细胞培养实验

编号2~7半胱氨酸透明质酸结合物Cys-HA用pH7.6的磷酸盐缓冲液配成浓度为10%(w/v)溶液,每份每孔250ul共5孔注入到96孔培养板上,四分支聚乙二醇氧酯结合物(4-ARM-PEG-S-S)也用同样的方法配成10%(w/v)溶液,每份同样取250ul与上述2~7号混合均匀后,再向每孔对应注入1%Ac-CGRGDSPG-NH2或1%Exenatide-NH2,混合均匀,30分钟以后用PBS洗涤3次,最后向每孔注入250ulRIN m5f细胞溶液,细胞浓度为5000个/cm2,细胞在标准条件下(37℃,5%CO2)培养48小时。

CCK实验步骤

在每组对应的96孔板中加入10ul CCK溶液,注意在加入的过程不要在孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数,加入完毕后将培养板放在培养箱中内孵育1~4小时(37℃,5%CO2),紧接着用酶标仪测定在450nm处的吸光度,采用以下公式进行计算得出每组的细胞活力。

细胞活力(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100

A(加药):具有细胞、CCK溶液和药物溶液的孔的吸光度

A(空白):具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度

A(0加药):具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液的孔的吸光度

实施例6

RIN m5f细胞荧光实验

荧光实验原理

Calcein-AM是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂,由于在Calcein(钙黄绿素)的基础上加强了疏水性,因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后,酯酶会将其水解为Calcein(钙黄绿素)留在细胞内并无法扩散出完整的膜结构,所以既能说明细胞活力,又能提示细胞的完整性。Ethidium homodimer-1是一种膜不通透的核酸染料,它能进入破损的细胞膜及核膜并对DNA进行染色,故可以识别死细胞。这两种染料都在495nm处激发,Calcein-AM在515nm处发绿光,Ethidiumhomodimer-1在635nm处发红光。

荧光实验步骤

RIN m5f细胞培养实验如上所述,在每组对应的96孔板中每孔各加入2ul用pH7.6的磷酸盐缓冲液配置的2mMCalcein-AM和2mM Ethidium homodimer-1溶液,加入完毕后将培养板放在培养箱中内孵育0.5小时(37℃,5%CO2),紧接着用荧光显微镜观察每组细胞生长状况。

实施例7

RIN m5f细胞胰岛素分泌实验

胰岛素分泌实验原理

实验采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验测定标本中大鼠胰岛素(Insulin)水平。用纯化的大鼠抗-胰岛素(Insulin)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入胰岛素(Insulin)与辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)标记的胰岛素抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的胰岛素(Insulin)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中大鼠胰岛素(Insulin)浓度。

胰岛素分泌实验步骤

1.标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔10孔,在第一、第二孔中分别加标准品100ul,然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50ul,混匀;然后从第一孔、第二孔中各取100ul分别加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50ul,混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取50ul弃掉,再各取50ul分别加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul,混匀;混匀后从第五、第六孔中各取50ul分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50ul,混匀后从第七、第八孔中分别取50ul加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分别加标准品稀释液50ul,混匀后从第九第十孔中各取50ul弃掉。稀释后各孔加样量都为50ul,浓度分别为48mu/l,24mu/l,12mu/l,6mu/l,3mu/l,0mu/l。

2.样品准备:编号2~7半胱氨酸透明质酸结合物Cys-HA用pH7.6的磷酸盐缓冲液配成浓度为10%(w/v)溶液,每份每孔500ul共5孔注入到48孔培养板上,四分支聚乙二醇氧酯结合物(4-ARM-PEG-S-S)也用同样的方法配成10%(w/v)溶液,每份同样取500ul与上述2~7号混合均匀后,再向每孔对应注入1%Ac-CGRGDSPG-NH2或1%Exenatide-NH2,混合均匀,30分钟以后用PBS洗涤3次,最后向每孔注入500ulRIN m5f细胞溶液,细胞浓度为1000个/cm2,细胞在标准条件(37℃,5%CO2)下培养48小时后,除去培养基,再用克-林二氏重碳酸盐缓冲液(Krebs-Ringer bicarbonate buffer)洗涤2次。用克-林二氏重碳酸盐缓冲液(Krebs-Ringer bicarbonate buffer)配置浓度3.3和16.7mmol/l葡糖糖溶液放在培养箱(37℃,5%CO2)中培养30分钟,每组细胞先用500ul浓度为3.3mmol/l葡糖糖平衡30分钟,然后再加入500ul浓度为3.3mmol/l葡糖糖并在培养箱(37℃,5%CO2)中培养60分钟。培养完毕后。从每组对应孔取500ul溶液于离心管中冰浴保存,在2500rpm0℃离心5分钟,每组取200ul的上清液用于胰岛素的测定,除去每组48孔板中所剩余的溶液,再加入500ul浓度为16.7mmol/l葡糖糖并在培养箱(37℃,5%CO2)中培养60分钟,后续按照ELISA试剂盒使用说明书进行操作。

下面为对上述实例合成一种硫醇-烯点击化学修饰形成的半胱氨酸功能化透明质酸结合物、制备的可注射原位形成的水凝胶的流变学性质,胰岛细胞培养实验,胰岛素分泌实验检测。

一、硫醇-烯点击化学修饰形成的半胱氨酸功能化透明质酸结合物修饰率

对比附图5~11和附图12,将化合物3的核磁共振氢谱的信号进行分析归属。1H NMR(D2O)显示在δ 5.88~5.98ppm处出现烯丙基(CH2=CH2-CH2-O-)信号,所以可判断该化合物为化合物3,通过比对δ 5.88~5.98ppm处出现烯丙基(CH2=CH2-CH2-O-)信号与δ 1.95ppm处透明质酸中乙酰氨基中甲基(-NH-COCH3)信号比值可计算出此步反应的修饰率约4.03%~64.11%(见附图20);

附图13~19为化合物8的核磁共振氢谱,对图中信号进行分析归属,1H NMR(D2O)显示在δ 1.37ppm处出现叔丁氧羰基(Boc)信号,所以可判断该化合物为化合物8,通过比对δ 1.37ppm处出现叔丁氧羰基(Boc)信号与δ 1.95ppm处透明质酸中乙酰氨基中甲基(-NH-COCH3)信号比值可计算出此步反应的修饰率约2.33%~45.67%(见附图20)。

二、硫醇-烯点击化学修饰形成的半胱氨酸功能化透明质酸结合物GPC结果

表7.右旋糖酐标准品GPC数据

表8.Cvs-HA*和HA(化合物1)的GPC数据

Cys-HA*:半胱氨酸功能化透明质酸结合物(化合物9),用GPC测其分子量(见附图21,图22~29),结果显示所测得样品的分子量和透明质酸钠(化合物1)的分子量比较,透明质酸分子经受本发明的化学修饰后没有变小、或降解,有些样品的分子量略大于透明质酸原料。

三、通过氧酯介导的自然化学连接交联的可注射原位形成的透明质酸水凝胶及其流变学研究

表9不同修饰率Cys-HA与4-ARM-PEG-S-S交联形成水凝胶的时间

备注:lg 10万HA含有2.636mmol伯醇;编号8为对照试验,验证最大修饰率的Cys-HA在一定的时间内没有通过二硫键交联形成水凝胶。

从水凝胶的形成流变学扫描图(见附图30~50)中可以看出:编号2~7号半胱氨酸透明质酸结合物溶液与四分支聚乙二醇氧酯结合物(4-ARM-PEG-S-S)溶液反应在6小时的测试时间内G’与G”出现交点,此点为凝胶点,即水凝胶形成的时间点,凝胶时间为70s~8145s之间(见附图52),随着时间的增加,G’处于上升趋势,最终渐渐达到水平,说明交联反应已经反应完全。编号2~7号凝胶点出现的时间随着修饰率的增加而逐渐递减,只有烯丙基缩水甘油醚为0.1当量时在5小时的测试时间内都没有凝胶点,并且从编号为8的流变学实验可以看出相同浓度最大修饰率的半胱氨酸透明质酸结合物在相同条件下6小时40分钟都没有凝胶点的出现(见附图51),编号2~7所形成的水凝胶在TCEP.HCl溶液中过夜依然是水凝胶状态,从这两方面可以说明编号2~7号半胱氨酸透明质酸结合物溶液与四分支聚乙二醇氧酯结合物(4-ARM-PEG-S-S)所形成的水凝胶是通过氧酯介导自然化学连接反应,而不是半胱氨酸巯基通过二硫键所形成的共价交联水凝胶。

四、RIN m5f细胞CCK实验结果

附图53为形成的透明质酸水凝胶样图。

从附图54中进行纵坐标对比:通过CCK实验细胞我们发现相同修饰率下,编号2~7半胱氨酸透明质酸结合物与四分支聚乙二醇氧酯结合物(4-ARM-PEG-S-S)溶液通过氧酯介导自然化学连接形成共价交联水凝胶进行RIN m5f细胞培养中,(1)添加细胞黏附因子的细胞活力明显比没有添加的有接近30%~55%细胞增长率,说明细胞黏附因子在以透明质酸-聚乙二醇水凝胶为细胞支架材料中RIN m5f细胞培养中起到积极作用。(2)在添加细胞黏附因子的实验组中Exenatide-NH2比Ac-CGRGDSPG-NH2对RIN m5f细胞增长率要高接近20%,与两者共同添加组相比细胞活力比较接近,说明Exenatide-NH2比Ac-CGRGDSPG-NH2更能刺激RIN m5f细胞生长繁殖。

横坐标对比:通过CCK实验细胞我们发现相同实验组,不同修饰率下编号2~7半胱氨酸透明质酸结合物与四分支聚乙二醇氧酯结合物(4-ARM-PEG-S-S)溶液通过氧酯介导自然化学连接形成共价交联水凝胶进行RIN m5f细胞培养中细胞活力也有差异,当烯丙基缩水甘油醚是透明质酸伯醇羟基(2.636mmol)的1当量时每组都有最大细胞活力数,在添加细胞黏附因子Ac-CGRGDSPG-NH2组尤为明显,当修饰率越大时每组细胞活力数趋于平缓,说明当烯丙基缩水甘油醚为1当量时,透明质酸-聚乙二醇水凝胶对RIN m5f细胞培养是最适宜的修饰率。

五、RIN m5f细胞荧光实验结果

从附图55~58可见,RIN m5f细胞荧光实验结果与CCK实验结果与讨论相似,添加活性多肽的水凝胶会促进细胞细胞的增长,多肽Exenatide-NH2在这方面尤为显著,在修饰率方面荧光实验不如CCK实验结果可以在数字上显示彼此差别,但是也会发现当烯丙基缩水甘油醚是透明质酸伯醇羟基(2.636mmol)的1当量时RIN m5f细胞拥有较好的生长状态。

六、RIN m5f细胞胰岛素分泌实验结果

胰岛素分泌标准曲线见附图59,通过RIN m5f细胞胰岛素分泌实验,我们可以发现相同条件下浓度为16.7mmol/l葡糖糖溶液刺激出的胰岛素浓度比3.3mmol/l葡糖糖溶液要多。

附图60~图61,纵坐标对比:每组相同浓度葡糖糖和相同修饰率下,编号2~7半胱氨酸透明质酸结合物与四分支聚乙二醇氧酯结合物(4-ARM-PEG-S-S)溶液通过氧酯介导自然化学连接形成共价交联水凝胶RIN m5f细胞胰岛素分泌实验:(1)葡糖糖浓度为3.3mmol/l、16.7mmol/l都出现添加细胞黏附因子的细胞分泌能力比没有添加的要强,说明细胞黏附因子在以透明质酸-聚乙二醇水凝胶为细胞支架材料中RIN m5f细胞胰岛素分泌实验起到积极作用。(2)在两组葡糖糖浓度中,添加细胞黏附因子的实验组中Exenatide-NH2比Ac-CGRGDSPG-NH2对刺激RIN m5f细胞胰岛素分泌要强,与两者共同添加组相比细胞活力比较接近,说明Exenatide-NH2比Ac-CGRGDSPG-NH2更能刺激RIN m5f细胞胰岛素分泌。

横坐标对比:通过RIN m5f细胞胰岛素分泌我们发现相同实验组,不同修饰率下编号2~7半胱氨酸透明质酸结合物与四分支聚乙二醇氧酯结合物(4-ARM-PEG-S-S)形成的水凝胶进行RIN m5f细胞胰岛素中胰岛素浓度存在差异,当烯丙基缩水甘油醚是透明质酸伯醇羟基(2.636mmol)的1当量时两组胰岛素分泌都有最大浓度存在,当修饰率越大时每组细胞活力数趋于下降趋势,说明当烯丙基缩水甘油醚为1当量时,透明质酸-聚乙二醇水凝胶对RIN m5f细胞胰岛素分泌为最佳修饰率。

综上所述,本发明具有以下特点:

1.定向修饰透明质酸的羟基、保留其游离的羧基,从而有利于其与细胞CD44结合,得到具有更好生物相容性的由稳定醚键连接的透明质酸结合物,并且所得到的透明质酸衍生物具有半胱胺基团,不仅增加了透明质酸的黏附性,还为其提供了可进一步化学修饰的功能基团,并且这种半胱氨酸透明质酸结合物还可用于形成可注射原位形成的共价交联透明质酸水凝胶,以及作为支架材料在胰岛细胞的培养和胰岛素的分泌的应用。

2.本发明采用冷冻干燥的的方法制备得到与透明质酸的N-乙酰-D-葡萄糖胺的羟基反应形成稳定醚键的一系列修饰率的烯丙基明质酸衍生物,冷冻干燥方法为今后在多糖及其他大分子修饰化学提供了新的思路。

3.利用硫醇-烯点击化学修饰将合成的半胱氨酸衍生物接到烯丙基透明质酸上,最后得到具有不同修饰率的半胱氨酸透明质酸结合物,此路线为不同于现在其他透明质酸功能化方法是一种新的创新合成路线,并且第一次使用在多糖的修饰化学中,为透明质酸的修饰以及其他多糖的修饰提供了新的方法参考。

4.半胱氨酸透明质酸结合物带有半胱胺基团,不仅增加了透明质酸的黏附性,还为其提供了可进一步化学修饰的功能基团,并与四分枝聚乙二醇氧酯通过氧酯介导自然化学连接制备可注射、原位形成共价交联的新的透明质酸水凝胶具有活性巯基,增加了透明质酸的黏附性用于细胞培养,也可进一步进行功能化修饰,比如与药物结合,起到药物缓控释的作用。

5.酯结构中的醇在OMNCL反应时会释放到溶液中,在设计酯的时候,可以把这个醇设计为羟基化的药物或细胞生长因子的前体,从而在水凝胶形成的同时,释放这些药物或生长因子到水凝胶中,从而增加了透明质酸在生物医药领域的应用。

6.流变学的测试中,加入反应的烯丙基缩水甘油醚的量从0.5~5当量,水凝胶的形成都是通过OMNCL反应共价交联而不是二硫键,并且修饰率越大,交联所需的时间也越少,所形成的水凝胶具有良好的流变学性质,具有凝胶时间可控、机械性能可控等优良性质。

7.水凝胶的RIN m5f细胞培养实验和RIN m5f细胞分泌胰岛素实验中,发现透明质酸-聚乙二醇水凝胶在细胞培养中作为支架材料的的重要性,以及细胞黏附因子在细胞生长过程中所起的意义。

8.通过加入烯丙基缩水甘油醚1当量修饰得到的透明质酸水凝胶对RIN m5f细胞活力和RIN m5f细胞胰岛素分泌都取得最优结果。从而为通过本发明合成的半胱氨酸透明质酸结合物以及与聚乙二醇共价交联的水凝胶在胰岛细胞的移植,糖尿病的治疗及其他医药领域的应用提供了新的方向。

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