调控植物耐旱性的花生AhALDH10基因及其应用的制作方法

文档序号:11126061阅读:889来源:国知局
调控植物耐旱性的花生AhALDH10基因及其应用的制造方法与工艺

本发明公开了调控植物耐旱性的花生AhALDH10基因,属于基因工程领域。



背景技术:

乙醛脱氢酶(ALDH)是一类依赖于NAD(P)+的酶类,负责催化生物体内各种醛类至对应羧酸。根据蛋白序列差异,植物中至今发现有13个ALDH家族(Sophos and Vasiliou 2003),除丙二醛等共通底物外,各家族ALDH有不同的专化底物,参与多条生化途径。多数ALDH由于有不同程度的解细胞醛毒功能,被认为参与植物盐、旱等胁迫响应(Brocker et al.2013),其中,ALDH10,12,18三类,由于参与甜菜碱与脯氨酸的代谢,作为耐逆相关ALDH被研究得较多。

ALDH10在植物中被认为参与氨基醛类的氧化,如氨基丁醛,所以又被称为氨基醛脱氢酶(AMADH)(Sebela et al.2000)。此外,ALDH10又被称为BADH,负责把甜菜醛(betaine aldehyde,BA)氧化成甜菜碱(glycinebetaine,GB),参与植物的耐逆途径,如菠菜(Incharoensakdi et al.2000),红树(Hibino et al.2001)和拟南芥(Missihoun 2011),虽然大多数作物中的ALDH10对甜菜醛的催化活性不如氨基醛。一些异源转基因实验也能从侧面验证ALDH10对提高植物耐逆能力有帮助(Zhou et al.2008)。



技术实现要素:

技术问题

本发明的目的在于提供一种调控植物耐旱性的花生AhALDH10基因及其应用。

技术方案

本发明提供一种调控植物耐旱性的花生AhALDH10基因,所述基因cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的调控植物耐旱性的花生AhALDH10基因编码的蛋白质,具有序列表中SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。

本发明所述AhALDH10基因的应用。具体指其通过植物表达载体转入目的植物内,能提高植物的耐旱性。所述植物优选是模式植物大豆。

有益效果

本发明公开了花生AhALDH10及其所编码的蛋白质,该基因在花生中为首次报道。荧光定量表达分析表明该基因受盐和旱诱导;转大豆功能验证显示,该基因能提高甜菜碱合成量1倍左右,从而提高植株对旱胁迫的抗性。

本发明提供的AhALDH10基因是首次在花生中分离的新基因,为花生中首次报道,AhALDH10与模式作物中的ALDH10基因有80%以上的蛋白序列同源,转大豆实验表明,其功能与植物耐旱相关,可作为目的基因导入植物,提高植物耐旱性,以进行植物品种改良。

附图说明

图1:PCR扩增后的凝胶电泳结果

注:图中第一道:DL2000marker;第二、三道:AhALDH10

图2:花生与模式作物ALDH10蛋白同源比较。

注:序列从上至下:拟南芥ALDH10a8,ALDH10a9,水稻ALDH10a5,ALDH10a8,花生AhALDH10

图3:qPCR分析AhALDH10基因在干旱和盐胁迫(4h、8h、12h)下在花生根、叶片中的表达情况

图4:转基因大豆土培法耐旱性鉴定结果

注:上:AhALDH10转基因大豆,下:对照;A处理前,B干旱处理2周,C复水1周

图5:对照和转基因大豆旱处理后叶片甜菜碱含量

具体实施方式

实施例1:AhALDH10基因的获得

选用花生品种:抗旱花生品种丰花1号,光照培养箱中萌发生长,待生长至3叶期幼苗,取部分叶片在液氮下快速研磨成粉状,利用RNA提取试剂盒(E.Z.N.A.TMPlant RNAKit,购自OMEGA公司)提取样品的总RNA,并用DNAse Ⅰ进行消化处理。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性,NanoDrop-2000型分光光度计检测总RNA的浓度和纯度。再通过反转录试剂盒将总RNA反转合成cDNA。

根据花生转录组测序结果,挑选了具有完整ORF的、注释为ALDH10基因家族的cDNA序列,根据其预测序列的5′和3′端的非编码区分别设计了特异性引物P1、P2(表1),以上述的cDNA为模板,以94℃预变性5min;94℃变性30s,58-60℃退火30s,72℃延伸60s,35个循环;72℃延伸10min为反应条件进行PCR扩增。扩增片段经1%琼脂糖凝胶电泳检测(图1),回收后连接到质粒载体pGEM-T,然后转化大肠杆菌菌株JM109感受态细胞,经选择性LB培养基(IPTG、X-gal、Amp)得到阳性克隆,菌液培养后测序分析。测得序列与预测序列一致,命名为AhMYB31,AhMYB31的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示,编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示;结构域和系统进化树分析表明与拟南芥、水稻已知的ALDH10基因有80%以上的蛋白同源(见图2),命名为AhALDH10。

表1:说明书中涉及的引物相关信息

实施例2:AhALDH10基因的表达分析

选用花生品种:抗旱花生品种丰花1号,光照培养箱中萌发生长,待生长至3叶期幼苗,分别进行干旱(20%PEG6000)及高盐(1%NaCl)处理,分别取0h、4h、8h、12h的叶片样品,液氮冷冻后,-80℃冰箱保存。再利用RNA提取试剂盒(E.Z.N.A.TM Plant RNAKit,购自OMEGA公司)分别提取样品的总RNA,并反转成cDNA。

基于AhALDH10序列设计定量引物P3、P4(表1),以花生TUA5基因引物为内参对照,根据Real Master Mix(SYBR Green)试剂盒(TaKaRa)操作说明配制反应体系,每个反应3次重复;反应程序为:94℃变性5min;94℃变性20s,55℃退火30s,72℃延伸40s,40个循环;于ABI PRISM 7000实时定量PCR仪上检测表达量。采用2-ΔΔCT算法(Livak K J,Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCt method.Methods,2001,25:402-408)分析试验结果,其中ΔΔCT=(CT样本-CTTUA5)Time x-(CT样本-CTTUA5)Time 0,其中CT样本和CTTUA5分别是AhALDH10和内参基因TUA5的CT值;Time x和Time 0分别为处理的不同时间点(胁迫处理4、8、12h)和对照(胁迫处理0h)。

结果如图3所示,AhALDH10在根中表达较高,干旱处理4h该基因表达量增加了10倍,盐胁迫4h后该基因表达量提高了5倍,可以看出该基因对于干旱胁迫更为敏感。此外,干旱处理4h后,花生叶片甜菜碱含量从12.4μmol·g-1上升至37.1μmol·g-1,说明甜菜碱途径参与到花生耐逆响应中。

实施例3:转化大豆及转基因功能验证

植物表达载体采用载体pTF101(带35S启动子和Bar筛选标记)(Takara公司),利用重组试剂盒进行载体构建。将获得的重组表达载体质粒转入农杆菌EHA105感受态,经选择性LB培养基(50mg/L Rif、100mg/L Kan)得到阳性克隆,菌液培养后通过农杆菌介导法转入大豆。收获的T0代种子分别经除草剂及基因引物进行阳性鉴定。获得的阳性株系继续种植,单株收获。

土培法耐旱性鉴定:将T2代转基因种子及野生型种子进行春化处理3-4天,再用次氯酸钠进行消毒后,播种至营养钵中,正常长至4叶期,用20%PEG6000进行模拟干旱处理(陈娜等,2014,核农学报,花生中胁迫相关基因AhDHN1的克隆及非生物胁迫下表达分析),对照进行正常浇水。2周后置换营养土,正常复水处理。

如图4,对照大豆干旱2周以后,已经基本萎蔫,复水处理后仍不能正生长,但转基因大豆干旱2周以后,叶片只是略有缺水症状,复水以后很快很恢复正常。同时我们对各样品大豆叶片中的甜菜碱含量也进行了测量,见图5,我们发现转基因大豆中甜菜碱含量在干旱过程中维持在一个较高的水平,比对照将近高出一倍,

综上所述本发明人提供的AhALDH10基因是首次在花生中分离的新基因,为花生中首次报道。AhALDH10与模式作物中的ALDH10基因有80%以上的蛋白序列同源,转大豆实验表明,其功能与植物耐旱相关,该基因能提高甜菜碱合成量1倍左右,从而提高植株对旱胁迫的抗性。AhALDH10可作为目的基因导入植物,提高植物耐旱性,以进行植物品种改良。

本发明涉及的序列及记号分列如下:

SEQ ID NO.1(1512bp)

ATGGAAATCCCAATCCCAACTCGACAGTTGTTCATTGACGGAGAATGGAAGCCCCCCATCCTCAGTAACAGAATTCCAATTATCAACCCTTCCACTCAGCAAGTCGTCGGGGACATTCCAGCTGCCACCAAGGAGGATGTAGACGCCGCCGTCGCCGCCGCTAGAAGAGCACTCAACCGCAACAAAGGCAACGACTGGCCTTCTGCTTCCGGCGCTCACCGAGCCCGCTATCTCCGCGCCATCGCTGCCAAGGTCGTCGAGAGAAAGGATCACCTCGCTAAGCTTGAATCCCTTGATTGCGGAAAACCACTCGATGAAGCTGCCTGGGACATGGATGATGTTGCTGGTTGCTTCGAGTTCTACGCTGACCTTGCCGAGAAACTCGACGCTAAGCAGAAGGCAACCGTTTCTCTTCCCATGGAAACTTTCAAGAGTTATGTCCTCAAAGAACCCATTGGTGTTGTTGGATTAATCACCCCATGGAACTATCCTCTGTTAATGGCTACATGGAAGGTTGCCCCTGCTCTGGCAGCTGGTTGTGCTGCGATATTGAAGCCTTCTGAATTGGCATCTGTGACATGTTTGGAGCTGGCTGACATATGCAAAGAAGTGGGCCTTCCTCCGGGTGTATTAAATATTCTCACTGGATTAGGCCCTGATGCTGGTGCTCCCTTAGCTTCCCACCCTGACGTAGACAAGATTGCCTTTACTGGAAGCTCTGCAACTGGAAGCAAGGTTATGACAGCTGCTGCACAATTAGTCAAGCCTGTCTCACTAGAGCTTGGTGGAAAAAGCCCAATCATTGTTTTTGAGGATGTTGATCTTGATAAGGCTGCTGAATGGACCCTCTTTGGTTGCTTCTGGACAAATGGTCAGATATGCAGTGCAACTTCCCGCCTTATTGTTCATGAAAGTATAGCAGCAAAATTTTTGGATACCCTTGTCAAATGGGCCAAAAACATCAAAGTTTCAGATCCCTTTGAAGAAGGTTGCAGGCTAGGCCCTGTTGTTAGTGAAGGACAGTATGAAAAAATATTGAAGTTTATCTCAAATGCTAAGAGTGAGGGCGCAACCATTTTGACTGGTGGATCTCGTCCAGAGCATCTAAAGAATGGATTTTTTATTGAACCAACCATTATAACGGATGTGACTACCTCCATGCAAATTTGGAAAGAAGAAGTATTTGGACCCGTGCTCTGTGTAAAAACATTTAGTACTGAGGAAGAGGCTCTCGATCTAGCACATGACACCATCTATGGGTTAGGAGCTGCTGTCATTTCAAATGACCTTGAAAGATGTGATCGTGTATCTAAGGCGTTTAAGGCTGGAATTGTATGGATCAATTGCTCTCAACCATGTTTTACTCAAGCCCCATGGGGAGGCACGAAACGTAGTGGTTTTGGTCGCGAATTAGGAGAATGGGGACTTGACAACTACTTGAGCGTGAAGCAAGTTACTCAGTATATCTCTAATGATCCATGGGGCTGGTACCAGTCTCCTTCAAAGCTGTGA

SEQ ID NO.2(503aa)

MEIPIPTRQLFIDGEWKPPILSNRIPIINPSTQQVVGDIPAATKEDVDAAVAAARRALNRNKGNDWPSASGAHRARYLRAIAAKVVERKDHLAKLESLDCGKPLDEAAWDMDDVAGCFEFYADLAEKLDAKQKATVSLPMETFKSYVLKEPIGVVGLITPWNYPLLMATWKVAPALAAGCAAILKPSELASVTCLELADICKEVGLPPGVLNILTGLGPDAGAPLASHPDVDKIAFTGSSATGSKVMTAAAQLVKPVSLELGGKSPIIVFEDVDLDKAAEWTLFGCFWTNGQICSATSRLIVHESIAAKFLDTLVKWAKNIKVSDPFEEGCRLGPVVSEGQYEKILKFISNAKSEGATILTGGSRPEHLKNGFFIEPTIITDVTTSMQIWKEEVFGPVLCVKTFSTEEEALDLAHDTIYGLGAAVISNDLERCDRVSKAFKAGIVWINCSQPCFTQAPWGGTKRSGFGRELGEWGLDNYLSVKQVTQYISNDPWGWYQSPSKL

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 调控植物耐旱性的花生AhALDH10基因及其应用

<130> 0

<160> 8

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 400

<212> DNA

<213> 丰花1号

<220>

<221> 花生AhALDH10基因

<222> (1)..(400)

<223>

<400> 1

atggaaatcc caatcccaac tcgacagttg ttcattgacg gagaatggaa gccccccatc 60

ctcagtaaca gaattccaat tatcaaccct tccactcagc aagtcgtcgg ggacattcca 120

gctgccacca aggaggatgt agacgccgcc gtcgccgccg ctagaagagc actcaaccgc 180

aacaaaggca acgactggcc ttctgcttcc ggcgctcacc gagcccgcta tctccgcgcc 240

atcgctgcca aggtcgtcga gagaaaggat cacctcgcta agcttgaatc ccttgattgc 300

ggaaaaccac tcgatgaagc tgcctgggac atggatgatg ttgctggttg cttcgagttc 360

tacgctgacc ttgccgagaa actcgacgct aagcagaagg 400

<210> 2

<211> 400

<212> PRT

<213> 丰花1号

<220>

<221> 花生AhALDH10基因编码的蛋白质

<222> (1)..(400)

<223>

<400> 2

Met Glu Ile Pro Ile Pro Thr Arg Gln Leu Phe Ile Asp Gly Glu Trp

1 5 10 15

Lys Pro Pro Ile Leu Ser Asn Arg Ile Pro Ile Ile Asn Pro Ser Thr

20 25 30

Gln Gln Val Val Gly Asp Ile Pro Ala Ala Thr Lys Glu Asp Val Asp

35 40 45

Ala Ala Val Ala Ala Ala Arg Arg Ala Leu Asn Arg Asn Lys Gly Asn

50 55 60

Asp Trp Pro Ser Ala Ser Gly Ala His Arg Ala Arg Tyr Leu Arg Ala

65 70 75 80

Ile Ala Ala Lys Val Val Glu Arg Lys Asp His Leu Ala Lys Leu Glu

85 90 95

Ser Leu Asp Cys Gly Lys Pro Leu Asp Glu Ala Ala Trp Asp Met Asp

100 105 110

Asp Val Ala Gly Cys Phe Glu Phe Tyr Ala Asp Leu Ala Glu Lys Leu

115 120 125

Asp Ala Lys Gln Lys Ala Thr Val Ser Leu Pro Met Glu Thr Phe Lys

130 135 140

Ser Tyr Val Leu Lys Glu Pro Ile Gly Val Val Gly Leu Ile Thr Pro

145 150 155 160

Trp Asn Tyr Pro Leu Leu Met Ala Thr Trp Lys Val Ala Pro Ala Leu

165 170 175

Ala Ala Gly Cys Ala Ala Ile Leu Lys Pro Ser Glu Leu Ala Ser Val

180 185 190

Thr Cys Leu Glu Leu Ala Asp Ile Cys Lys Glu Val Gly Leu Pro Pro

195 200 205

Gly Val Leu Asn Ile Leu Thr Gly Leu Gly Pro Asp Ala Gly Ala Pro

210 215 220

Leu Ala Ser His Pro Asp Val Asp Lys Ile Ala Phe Thr Gly Ser Ser

225 230 235 240

Ala Thr Gly Ser Lys Val Met Thr Ala Ala Ala Gln Leu Val Lys Pro

245 250 255

Val Ser Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ser Pro Ile Ile Val Phe Glu Asp

260 265 270

Val Asp Leu Asp Lys Ala Ala Glu Trp Thr Leu Phe Gly Cys Phe Trp

275 280 285

Thr Asn Gly Gln Ile Cys Ser Ala Thr Ser Arg Leu Ile Val His Glu

290 295 300

Ser Ile Ala Ala Lys Phe Leu Asp Thr Leu Val Lys Trp Ala Lys Asn

305 310 315 320

Ile Lys Val Ser Asp Pro Phe Glu Glu Gly Cys Arg Leu Gly Pro Val

325 330 335

Val Ser Glu Gly Gln Tyr Glu Lys Ile Leu Lys Phe Ile Ser Asn Ala

340 345 350

Lys Ser Glu Gly Ala Thr Ile Leu Thr Gly Gly Ser Arg Pro Glu His

355 360 365

Leu Lys Asn Gly Phe Phe Ile Glu Pro Thr Ile Ile Thr Asp Val Thr

370 375 380

Thr Ser Met Gln Ile Trp Lys Glu Glu Val Phe Gly Pro Val Leu Cys

385 390 395 400

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213>

<220>

<221> P1

<222> (1)..(22)

<223>

<400> 3

atggaaatcc caatcccaac tc 22

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213>

<220>

<221> P2

<222> (1)..(25)

<223>

<400> 4

tcacagcttt gaaggagact ggtac 25

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213>

<220>

<221> P3

<222> (1)..(22)

<223>

<400> 5

ttgcttcgag ttctacgctg ac 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213>

<220>

<221> P4

<222> (1)..(22)

<223>

<400> 6

acaccaatgg gttctttgag ga 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213>

<220>

<221> TUA5-F

<222> (1)..(21)

<223>

<400> 7

ctgatgtcgc tgtgctcttg g 21

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213>

<220>

<221> TUA5-R

<222> (1)..(23)

<223>

<400> 8

ctgttgaggt tggtgtaggt agg 23

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