猴免疫缺陷病毒的RT‑LAMP检测引物组、试剂盒及其检测方法与流程

本发明属于分子生物学
技术领域：
，涉及实验动物相关病原的检测方法，具体涉及一种猴免疫缺陷病毒(SIV)的RT-LAMP(ReverseTranscriptionandLoop-mediatedIsothermalAmplification，反转录环介导等温扩增反应)检测引物组、检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
：1985年发现了第一个SIV，又称为猴艾滋病病毒，随后数个病毒株从非洲猴子和亚洲恒河猴体内分离出来。SIV遗传学上主要分为SIVcpz、SIVsm、SIVmnd、SIVsyk和SIVagm五大支系，SIV具有宿主依赖性进化特点，从而使其在天然宿主中不致病，如SIVsm感染乌黑白脸猴，SIVagm感染非洲绿猴，SIVcpz感染黑猩猩等都不会使后者发病，但当SIV跨物种传播至非天然宿主，如亚洲恒河猴，通常会使其发病。SIVmac感染恒河猴的病程进展及临床表现与人类艾滋病非常相似。在潜伏期，外周血细胞CD4+T持续减少，CD4/CD8淋巴细胞比值下降；到艾滋病发病阶段，可出现慢性腹泻和消瘦,死亡时体重下降60％，同时并发全身性淋巴衰竭；终末阶段也可发生多种机会性感染。SIV已经被确认为是导致SAIDS的病原体，因此，在猴艾滋病动物模型建立之前一定要排除这种病原体的干扰。SIV感染的诊断除了检查临床症状，还要结合实验室诊断方法，常用的实验室诊断方法有PCR法、酶联免疫吸附试验(ELISA)法、间接免疫荧光(IFA)法、免疫印迹(WB)法、病毒分离法等。PCR法快速、灵敏，但其扩增产物需要进行再一次验证。病毒分离需要进行细胞培养，周期长、对试验设备要求高，因此，该方法不适合一般的检测。目前，对SIV的检测常用ELISA法和IFA法作为初筛，还必须用WB检测特异性抗体才能最终确诊。ELISA法和IFA法检测的假阳性率高及WB法操作程序复杂，在一定程度上限制了其应用范围。因此，不论是为了保障整个猴群的质量还是饲养人员、科研人员的人身安全，都有必要建立一种方便、快捷、灵敏、特异性强的检测方法。技术实现要素：本发明的一个目的在于提供一种猴免疫缺陷病毒的RT-LAMP检测引物组。本发明的另一个目的在于提供一种猴免疫缺陷病毒的RT-LAMP检测试剂盒。本发明的另一个目的在于提供猴免疫缺陷病毒的RT-LAMP检测方法。本发明所采取的技术方案是：一种猴免疫缺陷病毒的RT-LAMP检测引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物。其核苷酸序列分别如下所示：外引物：SIV-F3：5’-GCATTCACGCAGAAGAGA-3’(SEQIDNO:1)；SIV-B3：5’-CTGGCACTACTTCTGCTC-3’(SEQIDNO:2)；内引物：SIV-FIP：5’-TCTGCTGTTCCTGTTTCCACCGAAACACACTGAGGAAGCA-3’(SEQIDNO:3)；SIV-BIP：5’-ACCAACAGCACCATCTAGCGATGGCAGGTGGACATAGT-3’(SEQIDNO:4)；环引物：SIV-LF：5’-ACTAGGTGTCTCTGCACTATCT-3’(SEQIDNO:5)SIV-LB：5’-ACCCAGTACAACAAATAGGTGG-3’(SEQIDNO:6)。一种猴免疫缺陷病毒的RT-LAMP检测试剂盒，该检测试剂盒包括上述所述的检测引物组。优选的，检测试剂盒包含上述所述的引物组、DNA聚合酶、逆转录酶、RT-LAMP反应液、阳性对照和阴性对照。优选的，外引物、环引物、内引物的摩尔比为1：4：8。优选的，DNA聚合酶为BstDNA聚合酶。优选的，逆转录酶为AMV逆转录酶。优选的，RT-LAMP反应液含有10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mMMgSO4水溶液。优选的，阳性对照为含有目的基因片段的质粒DNA，阴性对照为DEPC水。一种猴免疫缺陷病毒的RT-LAMP检测方法，包括如下步骤：1)提取待检样品RNA；2)反转录环介导等温扩增反应：配制25μl反应体系，含有SIV-F30.2μM，SIV-B30.2μM，SIV-FIP1.6μM，SIV-BIP1.6μM，SIV-LF0.8μM，SIV-LB0.8μM，RT-LAMP反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，逆转录酶2.5U，待检DNA1～100ng，用DEPC水补齐到25μl；然后于63～65℃反应45～60min；3)结果分析：通过肉眼观察反应管中溶液是否变浑浊或通过琼脂糖凝胶电泳分析是否出现梯状条带。如反应管中溶液变浑浊或电泳出现梯状条带即为阳性，否则，为阴性。本发明的有益效果是：本发明具有高特异性、高灵敏度、快速高效、操作简便、结果易读等有益效果：1)高特异性：本发明根据猴免疫缺陷病毒(SIV)(GenBank登录号为KC522234.1)的主要核心蛋白基因(gag)的部分序列设计了6条特异性引物，应用上述6条引物，扩增靶序列的8个区域，8个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；2)高灵敏度：最低检测极限可达到1fg/μl含SIV目标片段的质粒DNA；3)快速高效：整个扩增只用45～60min即可完成，扩增产量可达109～1010个拷贝；4)操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行反转录等繁琐步骤，只需要恒温水浴锅即可反应，条件比较温和；5)结果易读：通过肉眼观察反应管中溶液是否变浑浊或通过琼脂糖凝胶电泳分析是否出现梯状条带对检测结果进行判读，适合非专业人士的现场检测。附图说明图1是实施例3特异性的检测结果图(1：DEPC水对照；2：阴性样品对照；3：猴D型逆转录病毒SRV1RNA；4：猴D型逆转录病毒SRV2RNA；5：猴D型逆转录病毒SRV3RNA；6：猴D型逆转录病毒SRV4RNA；7：猴嗜T淋巴细胞病毒I型STLV-IRNA；8：猴B病毒BVDNA；9：猴免疫缺陷病毒SIVRNA；10：猴免疫缺陷病毒SIV质粒DNA；M-MarkerDL2000)；图2是实施例4灵敏度的检测结果图(1：100pg/μl质粒DNA(SIV)；2：10pg/μl质粒DNA(SIV)；3：1pg/μl质粒DNA(SIV)；4：100fg/μl质粒DNA(SIV)；5：10fg/μl质粒DNA(SIV)；6：1fg/μl质粒DNA(SIV)；7：100ag/μl质粒DNA(SIV)；8：100ag/μl质粒DNA(SIV)；9：DEPC水对照)。具体实施方式以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1猴免疫缺陷病毒RT-LAMP检测试剂盒的建立猴免疫缺陷病毒的RT-LAMP(ReverseTranscriptionandLoop-mediatedIsothermalAmplification，反转录环介导等温扩增反应)检测试剂盒，包括RT-LAMP引物组、RT-LAMP反应液、BstDNA聚合酶、逆转录酶、阳性对照和阴性对照。(1)RT-LAMP引物设计：以猴免疫缺陷病毒(SIV)的主要核心蛋白基因序列(gag)为靶基因，利用软件设计SIV特异性RT-LAMP引物。引物序列见表1。表1.SIV特异性的RT-LAMP引物序列表(2)RT-LAMP反应液：10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mMMgSO4水溶液。(3)BstDNA聚合酶和AMV逆转录酶。(4)阳性对照为含有猴免疫缺陷病毒(SIV)要核心蛋白基因(gag)片段的质粒DNA，其制备方法为：以分离鉴定的猴免疫缺陷病毒RNA为模板，利用表1中的外引物(SEQIDNO:1和SEQIDNO:2)对SIVRNA进行反转录PCR，所得基因片段长度为258bp，序列如SEQIDNO:7所示，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中构建质粒，即为阳性对照。GCATTCACGCAGAAGAGAAAGTGAAACACACTGAGGAAGCAAAACAGATAGTGCAGAGACACCTAGTGGTGGAAACAGGAACAGCAGAAACTATGCCAAAAACAAGTAGACCAACAGCACCATCTAGCGGCAGAGGAGGAAATTACCCAGTACAACAAATAGGTGGTAACTATGTCCACCTGCCATTAAGCCCGAGAACATTAAATGCCTGGGTAAAATTGATAGAGGAAAAGAAATTTGGAGCAGAAGTAGTGCCAG(SEQIDNO:7)(5)阴性对照为DEPC水。实施例2猴免疫缺陷病毒的RT-LAMP检测方法用上述试剂盒按以下方法对猴免疫缺陷病毒(SIV)进行检测：(1)待检样品RNA的提取：采用美基生物公司的病毒RNA提取试剂盒提取待检样品的RNA；(2)反转录环介导等温扩增反应：25μl反应体系含有：SIV-F30.2μM，SIV-B30.2μM，SIV-FIP1.6μM，SIV-BIP1.6Μm,SIV-LF0.8μM，SIV-LB0.8μM，RT-LAMP反应液12.5μl，BstDNA聚合酶8U，AMV逆转录酶2.5U，待检RNA1～100ng，用DEPC水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，于65℃反应60min。(3)结果判断：通过肉眼观察溶液是否变浑浊或通过琼脂糖凝胶电泳分析是否出现梯状条带判定结果；如反应管中溶液变浑浊或电泳出现梯状条带即为阳性，否则，为阴性。实施例3特异性实验用实施例2的方法分别对猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA、猴D型逆转录病毒(SRV)RNA、猴淋巴细胞趋向性病毒(STLV)RNA、猴B病毒(BV)DNA进行检测。鉴定结果显示：以猴免疫缺陷病毒(SIV)RT-LAMP引物组为引物，SIVRNA及质粒DNA反应管中溶液明显变浑浊，电泳后出现明显梯状条带，阴性对照及SRV、STLV、BV等反应管溶液未出现浑浊，同时电泳也未出现梯状条带，显示出本发明检测引物及方法具有良好的特异性。(见图1)。实施例4灵敏度实验将已构建的猴免疫缺陷病毒(SIV)质粒DNA作10倍梯度稀释，用实施例2的操作方法分别对稀释后的猴免疫缺陷病毒(SIV)质粒DNA进行检测。鉴定结果显示：以SIVRT-LAMP引物组为引物，SIV质粒DNA按10倍梯度进行稀释，结果显示100pg/μl到1fg/μl的浓度的SIV质粒DNA2个反应管溶液均变浑浊，电泳后出现明显梯状条带，100ag/μl、10ag/μl的浓度及阴性水对照等反应管溶液未出现浑浊，同时电泳也未出现梯状条带。(见图2)。实施例5不同检测引物及方法检测效果的比较用实施例2的方法采用不同LAMP检测按照实施例4中的步骤进行检测，同时采用及荧光定量PCR引物进行检测，比较不同检测引物组及不同检测方法的检测效果，其他检测引物组的序列及检测效果如表2和表3。表2其他检测引物组及荧光定量PCR引物表3不同检测引物及方法检测效果本发明检测引物A检测引物组B检测引物C荧光定量PCR引物检测灵敏度1fg/ul(+/+)10fg/ul(+/-)1fg/ul(+/-)10fg/ul(+/+)阴性对照检测结果阴性(-/-)阴性(-/-)阳性(+/-)阴性(-/-)备注：(+/+)代表2次重复均为阳性，(+/-)代表2次重复有一次为阴性，一次为阳性，(-/-)代表两次重复均为阴性检测结果显示：本发明的引物组与其他引物组及荧光定量PCR检测方法相比，具有灵敏度高特点，同时也无假阳性现象出现。以上实施例表明，本发明的方法具有高特异性、高灵敏度、快速高效、操作简便、结果易读等优点，适于在各基层动物疫病监测单位和实验猴养殖企业中进行推广应用。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。<110>广东省实验动物监测所<120>猴免疫缺陷病毒的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及其检测方法<130><160>22<170>PatentInversion3.5<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1gcattcacgcagaagaga18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>2ctggcactacttctgctc18<210>3<211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