一种玉米纹枯病菌SSR标记及其制备方法、应用与流程

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种玉米纹枯病菌SSR标记及其制备方法、应用。

背景技术：

微卫星DNA，又称简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)，是一种由2-6 个核苷酸为单位均匀分布于基因组中的重复序列，在各种生物体内广泛分布。微卫星具有多态性高、共显性遗传、数量丰富、高分辨率、基因组覆盖距离广和易于检测等优点，使得SSR标记成为广泛使用的分子标记之一。分离微卫星位点的方法有多种，例如数据库查询法、近缘物种筛选法、基因组文库筛选法、富集文库法以及EST-SSR 法等。由于磁珠富集法具有高效富集微卫星DNA 的作用，且不需要较多的物种基因组信息，被广泛地运用于微卫星位点的筛选。

玉米是世界上分布最广泛的粮食作物之一，种植面积仅次于小麦和水稻，是粮食、饲料、工业原料和出口商品的多用途作物。我国的玉米种植面积和总产量仅次于美国，居世界第二位。然而，玉米纹枯病是玉米产区广泛发生的一种土传性病害，严重影响玉米的产量，造成巨大的经济损失，其病原菌是立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kühn），该菌寄主范围十分广泛，能侵染水稻、玉米、大豆、小麦等43科263种植物，引起纹枯、立枯等病症。但是对于玉米纹枯病菌的遗传学研究较少，特别是DNA 分子水平的研究极为有限。在玉米纹枯病菌遗传多样性的研究基础一直比较薄弱，在公共数据库中能得到的序列信息比较有限。因此，建立高效、全面、稳定的SSR技术的应用对玉米纹枯病菌遗传多样性的揭示具有很好的补充意义。

为了研究玉米纹枯病菌的遗传多样性，申请人利用磁珠法富集分离了玉米纹枯病菌的SSR 序列，并从中开发了SSR 引物序列，利用开发的标记对玉米纹枯病菌进行了遗传多样性研究的应用。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明的目的是在于提供了一种玉米纹枯病菌SSR 标记的制备方法，该方法易行，所需设备简单，操作简便，在不需要了解测试样品较多的遗传背景信息的情况下，能够在短时间内高效富集和分离微卫星DNA，从而分析获得其特异的SSR引物序列。

本发明的另一个目的是在于提供SSR标记在分析玉米纹枯病菌遗传多样性中的应用，所得到的SSR 引物具有较高的针对性，同时由于SSR标记自身具有数量丰富，多等位基因和呈共显性遗传等优点，不仅能够用于玉米纹枯病菌遗传多样性和亲缘关系分析，还可以运用到玉米纹枯病菌遗传图谱的构建、目标基因的克隆等研究中。

所述的一种玉米纹枯病菌SSR标记，其特征在于包括引物对MA1、MA3、MA4、MA8、MA10、MA11、MA12和MA14，所述的引物对MA1包括引物MA1F和引物MA1R，所述的引物对MA3包括引物MA3F和引物MA3R，所述的引物对MA4包括引物MA4F和引物MA4R，所述的引物对MA8包括引物MA8F和引物MA8R，所述的引物对MA10包括引物MA10F和引物MA10R，所述的引物对MA11包括引物MA11F和引物MA11R，所述的引物对MA12包括引物MA12F和引物MA12R，所述的引物对MA14包括引物MA14F和引物MA12R，

所述的MA1F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，

所述的MA1F的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，

所述的MA3F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，

所述的MA3R的核苷酸序列如 SEQ ID No.6所示，

所述的MA4F的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，

所述的MA4R的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，

所述的MA8F的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，

所述的MA8R的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示，

所述的MA10F的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示，

所述的MA10R的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示，

所述的MA11F的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示，

所述的MA11R的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示，

所述的MA12F的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示，

所述的MA12R的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示，

所述的MA14F的核苷酸序列如SEQ ID No.27所示，

所述的MA14R的核苷酸序列如SEQ ID No.28所示。

所述的一种玉米纹枯病菌SSR标记在分析玉米纹枯病菌遗传多样性中的应用。

所述的一种玉米纹枯病菌SSR标记的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

a）采用水琼脂法分离玉米纹枯病菌；

b）从玉米纹枯病菌菌丝体中提取基因组总DNA；

c）利用限制性内切酶酶切上述步骤 b）所提取的总DNA，并获得基因组DNA 片断；

d）探针与目的片断的杂交：

在分子杂交炉内将预扩增产物与5’端生物素标记的探针(AG)₁₂、(TCG)₈、(GTC)₈、(GCT)₈杂交6-8h，杂交反应为100μL 体系：20×SSC：15μL；10% 质量体积比SDS ：0.5μL；10 μL Sau3A L（10μM）；10 μL含接头的DNA模板（100 ng/μL）；生物素探针：1μL（10μM）；ddH₂O ：67.6μL，各探针的杂交温度为：(AC)₁₂ 55℃、(TCG)₈ 65℃、(GTC)₈ 65℃和(GCT)₈ 65℃，获得的杂交液置4℃保存备用；

e）利用磁珠对上述步骤d）中的含有SSR 序列的DNA 片段进行富集：

（1）磁珠预处理：取一管包被有链亲和素的磁珠，拍打管底，然后用枪吹打直至磁珠分离开，用磁力架收集，磁珠悬停30s，吸走上清液；用0.5×SSC 洗涤磁珠3次，每次5min，每次洗涤完毕即用磁力架固定磁珠，至磁珠光滑为止；最后，加入含 0.1% SDS 的6×SSC200 μL于管中重悬磁珠以备用；

（2）磁珠富集：将备用杂交液加入到磁珠管中，室温下放置1h，每隔3min 翻转磁珠，使其混合均匀；用磁力架收集去掉上清液；用含0.1%SDS的 6×SSC洗涤磁珠2次，每次10min，之后分别加入200μL 6×SSC和200μL 3×SSC于室温下洗涤磁珠2次，每次洗涤10min；

（3）磁珠与目的片段的分离：加入50 μL 0.15mol/L的NaOH在室温下反应30 min，取上清加入5.5 μL 10×TBE和3.25 μL 1.25 mol/L的乙酸中和NaOH，这时溶液中含有单链的目标DNA序列，迅速用磁珠吸附管壁，并将含目的DNA片段移至新的离心管中；

（4）含有SSR 序列的DNA 片断的PCR 扩增：对洗脱后的目的DNA 进行PCR 扩增，扩增体系为20μL，PCR 反应程序为：95℃预变性2min；然后，95℃变性30s，60℃退火50s，72℃延伸1min，进行35个循环；最后，72℃延伸10min；取4μL 扩增产物产物使用1% 琼脂糖电泳检测，判断产物分布范围及产物量；

f）对上述步骤e）中所得含有SSR序列的DNA片断进行扩增并纯化；

g）将上述步骤f）中所得的DNA片断进行克隆测序；

h）在测序的基础上，用DNAstar软件编辑序列，去掉载体序列和接头序列，用SSR Hunter软件对插入序列进行分析，找出其中的微卫星DNA区域；

i）利用微卫星DNA 两侧的序列的保守性，运用软件Primer 5.0 设计特异性引物，用于扩增该位点的微卫星片断，引物设计：引物长度为18-23bp，退火温度为50-65℃，PCR 扩增产物长度为120-150bp，正反引物间Tm值相差不超过3℃，GC 含量为20%-80%，得到14对SSR 引物序列，包括引物对MA1、MA2、MA3、MA4、MA5、MA6、MA7、MA8、MA9、MA10、MA11、MA12、MA13和MA14。

所述的引物对MA1包括引物MA1F和引物MA1R，所述的引物对MA2包括引物MA2F和引物MA2R，所述的引物对MA3包括引物MA3F和引物MA3R，所述的引物对MA4包括引物MA4F和引物MA4R，所述的引物对MA5包括引物MA5F和引物MA5R，所述的引物对MA6包括引物MA6F和引物MA6R，所述的引物对MA7包括引物MA7F和引物MA7R，所述的引物对MA8包括引物MA8F和引物MA8R，所述的引物对MA9包括引物MA9F和引物MA9R，所述的引物对MA10包括引物MA10F和引物MA10R，所述的引物对MA11包括引物MA11F和引物MA11R，所述的引物对MA12包括引物MA12F和引物MA12R，所述的引物对MA13包括引物MA13F和引物MA13R，所述的引物对MA14包括引物MA14F和引物MA12R；

所述的MA1F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，

所述的MA1F的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，

所述的MA2F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，

所述的MA2F的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，

所述的MA3F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，

所述的MA3R的核苷酸序列如 SEQ ID No.6所示，

所述的MA4F的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，

所述的MA4R的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，

所述的MA5F的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，

所述的MA5F的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，

所述的MA6F的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，

所述的MA6F的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，

所述的MA7F的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，

所述的MA7F的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示，

所述的MA8F的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，

所述的MA8R的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示，

所述的MA9F的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示，

所述的MA9F的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示，

所述的MA10F的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示，

所述的MA10R的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示，

所述的MA11F的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示，

所述的MA11R的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示，

所述的MA12F的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示，

所述的MA12R的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示，

所述的MA13F的核苷酸序列如SEQ ID No.25所示，

所述的MA13F的核苷酸序列如SEQ ID No.26所示，

所述的MA14F的核苷酸序列如SEQ ID No.27所示，

所述的MA14R的核苷酸序列如SEQ ID No.28所示。

所述的制备方法，其特征在于所述的步骤c）具体包括：

取20μg 总DNA，在100μL 酶切体系中，用限制性内切酶Sau 3AI于37℃酶切4 h，然后65℃温育10min，酶切结束后于1%质量体积比琼脂糖凝胶电泳分离，回收300-900 bp的DNA片段；

回收片段连接上接头，连接反应为50μL 体系，反应在16℃下连接过夜，连有接头的DNA 经PCR 预扩增获得拷贝，预扩增引物为Sau 3AI F，所述的预扩增引物Sau 3AI F的核苷酸序列如SEQ ID No.29所示，PCR 反应体系20μL；PCR 反应程序为：95℃预变性5min；然后，95℃变性30s，60℃退火50s，72℃延伸1min，循环次数35个；最后，72℃终延伸10min；

取3μL 扩增产物使用1% 质量体积比琼脂糖电泳检测，判断产物分布范围及产物量，余下部分置4℃保存备用。

所述的制备方法，其特征在于所述的酶切体系为：20μg基因组DNA，40 U Sau 3AI酶和10μL 10 ´ enzyme buffer。

所述的制备方法，其特征在于所述的接头包括接头Sau 3AI F和接头Sau 3AI R，所述的接头Sau 3AI F的核苷酸序列如SEQ ID No.29所示，所述的接头Sau 3AI R的核苷酸序列如SEQ ID No.30所示。

所述的制备方法，其特征在于所述的PCR 反应体系20μL为：100 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，1U Taq DNA聚合酶，2.5 mmol/L MgCl₂，200 µmol/L dNTPs，200 µmol/L引物Sau 3AI F，100 ng DNA模板，ddH2O补足体积至20μL。

所述的制备方法，其特征在于所述的步骤g）具体包括：

目的DNA 片断的体外连接：将回收纯化后的PCR 产物，使用连接试剂盒进行，反应体系为10μL，16℃连接过夜；

连接产物的转化：采用热激法将目的片断的载体转化入DH-5α感受态细胞：加入5μL 连接产物于DH-5α感受态细胞中，冰浴30min；42℃热激90s，再冰浴5min，然后加入1mL不含氨苄的液体LB 培养基，于37℃的转速为150rpm的摇床上复苏培养45min；取100μL 菌液涂布于LB 平板上，倒置于37℃过夜；

挑选阳性克隆并测序：用菌落PCR 技术筛选阳性克隆，首先使用通用引物M13-47，其核苷酸序列如SEQ ID No.31所示和RV-M，其核苷酸序列如SEQ ID No.32所示，与不含生物素探针标记的重复序列组成的三引物，对菌液进行PCR 扩增筛选，反应体系20μL，PCR 反应程序为：95℃预变性5min；然后，5个循环的95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s；接着，30个循环的92℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸55s；最后，72℃延伸10min；所得PCR产物在1% 的琼脂糖凝胶上电泳，挑选不同大小的阳性克隆送样测序。

所述的制备方法，其特征在于所述的反应体系为：1U Taq DNA聚合酶、100 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L KCl、2.5 mmol/L MgCl₂、200 µmol/L dNTPs、200 µmol/L M13-47、200 µmol/L RV-M、200 µmol/L无biotin探针和2 μL菌液。

所述的制备方法，其特征在于所述的步骤i）中PCR反应体系为10 µL，含有100 ng DNA模板，200 µmol/L 上下游引物，100 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，1U Taq DNA聚合酶，2.5 mmol/L MgCl₂，200 µmol/L dNTPs；反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，54-58℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30个循环；72℃延伸10 min；最后，4℃保存；扩增产物按照5:1 的体积比加入上样缓冲液，95℃变性5min，在8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，80W恒功率电泳3h，用银染法进行染色、显色、定影，凝胶成像仪记录凝胶图像。

本发明的有益效果为：

对于绝大多数非模式生物，SSR相关资料很少。开发这些生物的SSR标记对群体遗传学研究尤为重要。目前，开发SSR 引物的方法主要有四种：一是从公共数据库中搜索微卫星位点；二是利用近缘物种间引物的通用性；三是构建小插入片段基因组文库；四是构建微卫星富集文库。此外，基于转录组测序或全基因组测序的微卫星位点筛选策略也陆续见报道。其中，磁珠富集法因具有高效、快速富集微卫星DNA的特点，被广泛应用于微卫星位点的筛选。

本研究中建立的以磁珠富集法为基础筛选玉米纹枯病菌SSR 序列并开发其相应的SSR引物的方法，便捷高效，通用性较好，能在短时间内开发大量的SSR标记，不仅能够用于玉米纹枯病菌遗传多样性和亲缘关系分析，还可以应用到玉米纹枯病菌遗传图谱的构建、目标基因的克隆中。

与其它分子标记相比，SSR具有等位基因变异多、多态性丰富、信息含量高；稳定性好、进化所受选择压小、呈共显性遗传等优点；而且在种属间有良好的通用性；扩增产物能通过电泳分析并根据片段大小分离等位基因进行检测。因此，SSR 标记已被作为重要的遗传标记，广泛应用于群体遗传学、亲本溯源、杂交物种形成、遗传连锁图谱构建、进行系谱分析、基因定位和物种起源与进化分析、比较基因组学等领域中。玉米纹枯病作为玉米的主要病害之一，对该病原菌的研究较少，国际上还没有基于玉米纹枯病菌的序列开发的专有分子标记，本发明为了获得足够的微卫星位点用于玉米纹枯病菌的群体遗传多样性研究提供强有力的技术支持。

附图说明

图1是玉米纹枯病菌基因组DNA检测电泳图，图1中第1孔（从左至右）为λdna/HindIII DNA Marker，条带大小从上到下为：23130、9416、6557、4361、2322、2027、567bp；2-8孔为玉米纹枯病菌基因组DNA样品。

图2是菌液PCR产物示意图，图2中第1孔（从左至右）为100bp DNA Marker，条带大小从上到下为：1500、1200、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100bp；2-15孔为菌液为模板的PCR产物。

图3是SSR标记MA1（3-A）、MA3（3-B）、MA4（3-C）、MA8（3-D）、MA10（3-E）、MA11（3-F）、MA12（3-G）、MA14（3-H）检测玉米纹枯病菌的聚丙烯酰氨凝胶电泳结果图。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例1：一种磁珠富集法筛选玉米纹枯病菌SSR 标记的制备方法

1、供试材料：60个玉米纹枯病菌菌株。

2、采用水琼脂法分离玉米纹枯病菌；具体方法参照周而勋, 杨媚. 从植物病组织中分离立枯丝核菌的快速、简便技术. 华南农业大学学报, 1998, 19(1):125-126。

3、取玉米纹枯病菌的菌丝，采用CTAB法提取基因组总DNA ；挑取玉米纹枯病菌的菌丝体接种于马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）中，恒温摇床振荡培养（28℃，120 r/min）6 d 后，收集菌丝体。CTAB法提取基因组总DNA具体方法参照黄培堂等译，分子克隆实验指南(第三版)(中译版)，2002。取5μL的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测DNA 质量（见图1）。

4、Sau 3AI接头的制备：将Sau 3AIF（5’- GGC CAG AGA CCC CAA GCT TCG -3’，如SEQ ID No.29所示）和Sau 3AI R（3’-CCG GTC TCT GGG GTT CGA AGC CTA G-PO₄ -5’， 如SEQ ID No.30所示）核苷酸链配成200 pmol/μL溶液；分别取等摩尔溶液混合，80℃变性5-10 min，在室温下自然冷却1 hr形成具有粘末端的接头，加dd H₂O配成终浓度为10 pmol/μL溶液。

5、探针与目的片断的杂交

（1）玉米纹枯病菌基因组DNA 片段的酶切：取约20μg基因组DNA，在100μL酶切体系(40 U Sau 3AI酶和10μL 10 ´ enzyme buffer)中，用限制性内切酶Sau 3AI于37℃酶切4h，然后65℃温育10min。

（2）玉米纹枯病菌基因组DNA片段连接接头：酶切结束后连接上Sau 3AI接头，连接反应为50μL 体系(2.5μg的酶切回收片段、25 pmol的接头和4 μL的T4 DNA连接酶和10 ´ T4 DNA Buffer 5μL)，反应在16℃下连接过夜。连接头的DNA 经PCR 预扩增获得多拷贝，预扩增引物为Sau 3AI F：5’- GGC CAG AGA CCC CAA GCT TCG -3’（如SEQ ID No.29所示），PCR 反应体系20μL，含有100 ng DNA模板（连接头产物），100 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，1U Taq DNA聚合酶，2.5 mmol/L MgCl₂，200 µmol/L dNTPs，200 µmol/L Sau 3AI F。PCR 反应程序为：95℃预变性5min；然后，95℃变性30s，60℃退火50s，72℃延伸1min，循环次数35个；最后，72℃延伸10min。取3μL 扩增产物产物使用1％ ( 质量体积比) 琼脂糖电泳检测，判断产物分布范围及产物量，余下部分置4℃保存备用。

（3）基因组片断与生物素探针杂交：在分子杂交炉内，将预扩增产物与5’端生物素标记的探针(AC)₁₂、(TCG)₈、(GTC)₈及(GCT)₈杂交6-8h，杂交反应为100μL 体系(10 μL含接头的DNA模板（100 ng/μL），1 μL生物素探针（10μM）；10 μL Sau3A L（10μM）；20 ´ SSC 15μL；10% SDS 0.5μL)，获得的杂交液置4℃保存备用。

6、磁珠富集含有SSR序列的DNA 片断，方法如下：

（1）磁珠预处理：取1-2mg 包被有链亲和素的磁珠，用0.5×SSC 洗涤磁珠3 次，每次5min(300μL/次)，每次洗涤完毕即用磁力架固定磁珠，至磁珠光滑为止，洗好的磁珠置于6×SSC（含 0.1% SDS）200 μL于管中重悬磁珠以备用。

（2）磁珠富集：将备用杂交液加入到磁珠管中，室温下放置30min，每3min 翻转磁珠，使其混合均匀，动作要轻，避免磁珠沉淀。之后分别加入200 μL 6×SSC（无SDS）和200 μL 3×SSC（无SDS）于室温下洗涤磁珠2次，每次10min。

（3）磁珠与目的片段的分离：加入50 μL 0.15mol/L的NaOH在室温下反应30 min，取上清加入5.5 μL 10×TBE和3.25 μL 1.25 mol/L的乙酸中和NaOH，此时溶液中含有单链的目标DNA序列，用磁珠迅速吸附管壁，并将含目的DNA片段移至新的离心管中。

（4）含有SSR 序列的DNA 片断的PCR 扩增：对洗脱后的目的DNA 进行PCR 扩增，扩增体系为20μL(单链目的片段、10 pmol/μL Sau 3AI F单链引物、1U Taq DNA聚合酶、100 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L KCl、2.5 mmol/L MgCl₂和200 µmol/L dNTPs)。PCR反应程序为：95℃预变性5min；然后，95℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸1min ，进行35个循环；最后，72℃终延伸10min。取4μL 扩增产物产物使用1％ (质量体积比)琼脂糖电泳检测，判断产物分布范围及产物量。

（5）扩增产物的纯化：PCR 扩增后的产物，切取300bp-900bp 的DNA 片段范围内的琼脂糖凝胶装在1.5mL 小离心管中，使用TaKaRa公司的凝胶回收试剂盒回收PCR 扩增产物，回收后的DNA 在EB 染色的1％ (质量体积比) 琼脂糖凝胶上电泳，检测回收DNA 的质量，置于-20℃保存备用。

7、含有SSR 序列的DNA 片断的克隆测序

（1）目的DNA 片断的体外连接：将回收纯化后的PCR 产物，使用TaKaRa公司的连接试剂盒进行，反应体系为10μL(4.5μL富集的DNA、0.5μL pMD-18T 载体和5μL Solution I溶液)，16℃连接过夜。

（2）连接产物的转化：采用热激法将目的片断的载体转化入DH-5α感受态细胞。加入5μL 连接产物于DH-5α感受态细胞中，冰浴30min。42℃热激90s，再冰浴5m，然后加入1mL液体LB 培养基(不含氨苄)，于37℃的摇床(150rpm) 上复苏培养45min。取100μL 菌液涂布于LB 平板上，倒置于37℃过夜(12-16hr)；

（3）挑选阳性克隆并测序：用菌落PCR 技术筛选阳性克隆，首先使用M13-47（5’- CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC -3’， 如SEQ ID No.31所示）和RV-M（5’- GAGCGGATAACAATTTCACACAGG -3’， 如SEQ ID No.32所示）与重复序列组成的三引物进行筛选阳性克隆。反应体系为20μL(1U Taq DNA聚合酶、100 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L KCl、2.5 mmol/L MgCl₂、200 µmol/L dNTPs、200 µmol/L M13-47、200 µmol/L RV-M、200 µmol/L探针（无biotin）和2 μL菌液)。反应条件为：95℃预变性5min；接着，5个循环的95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s；然后，30个循环的92℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸55s；最后，72℃延伸10min。所得PCR 产物在1％ (质量体积比) 的琼脂糖凝胶上电泳（图2），判断产物有无及其大小，挑选不同大小的有明亮清晰条带的阳性克隆送样测序。

8、用DNAstar软件(http://www.dnastar.com/)编辑序列，去掉载体序列和接头序列，用SSR Hunter软件(李强, 万建民. SSRHunter, 一个本地化的SSR 位点搜索软件的开发. 遗传, 2005, 27（5）：808-810)对插入序列进行分析，找出其中的微卫星DNA区域。

9、设计引物扩增基因组DNA ：根据微卫星DNA 两侧序列的保守性，运用软件Primer Premier 5.0（Rozen S, Skaletsky H J. PRIMER 3 on the WWW for general users and for biologist programmers [M]//KRAWETZ S, MISENER S. Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Totowa, New Jersey: Humana Press, 2000, 365-386.），设计特异性引物，扩增该位点的微卫星片断，引物设计采用以下严谨度：引物长度为18-23bp，退火温度为50-65℃，PCR 扩增产物长度为120-150bp，正反引物间Tm值相差不超过3℃，GC 含量为20%-80%。获得了14对引物如表1所示（MA1、MA2、MA3、MA4、MA5、MA6、MA7、MA8、MA9、MA10、MA11、MA12、MA13和MA14），其中8对引物（MA1、MA3、MA4、MA8、MA10、MA11、MA12和MA14）PCR扩增条带具有多态性。

所述的引物对MA1包括引物MA1F和引物MA1R，所述的引物对MA2包括引物MA2F和引物MA2R，所述的引物对MA3包括引物MA3F和引物MA3R，所述的引物对MA4包括引物MA4F和引物MA4R，所述的引物对MA5包括引物MA5F和引物MA5R，所述的引物对MA6包括引物MA6F和引物MA6R，所述的引物对MA7包括引物MA7F和引物MA7R，所述的引物对MA8包括引物MA8F和引物MA8R，所述的引物对MA9包括引物MA9F和引物MA9R，所述的引物对MA10包括引物MA10F和引物MA10R，所述的引物对MA11包括引物MA11F和引物MA11R，所述的引物对MA12包括引物MA12F和引物MA12R，所述的引物对MA13包括引物MA13F和引物MA13R，所述的引物对MA14包括引物MA14F和引物MA12R；

所述的MA1F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，

所述的MA1F的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，

所述的MA2F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，

所述的MA2F的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，

所述的MA3F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，

所述的MA3R的核苷酸序列如 SEQ ID No.6所示，

所述的MA4F的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，

所述的MA4R的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，

所述的MA5F的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，

所述的MA5F的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，

所述的MA6F的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，

所述的MA6F的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，

所述的MA7F的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，

所述的MA7F的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示，

所述的MA8F的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，

所述的MA8R的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示，

所述的MA9F的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示，

所述的MA9F的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示，

所述的MA10F的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示，

所述的MA10R的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示，

所述的MA11F的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示，

所述的MA11R的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示，

所述的MA12F的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示，

所述的MA12R的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示，

所述的MA13F的核苷酸序列如SEQ ID No.25所示，

所述的MA13F的核苷酸序列如SEQ ID No.26所示，

所述的MA14F的核苷酸序列如SEQ ID No.27所示，

所述的MA14R的核苷酸序列如SEQ ID No.28所示。

表1：上游、下游引物序列

实施例2：一种磁珠富集法筛选玉米纹枯病菌SSR 标记在分析玉米纹枯病菌遗传多样性中的应用

（1）用所设计的SSR 引物扩增60个玉米纹枯病菌材料；

供试材料均采自浙江省杭州中国水稻研究所富阳试验基地。从60个玉米纹枯病菌的的菌丝体中提取总DNA，并进行PCR扩增。PCR 反应的总体积为10μL(DNA：10ng ；10pmol/L 上下游引物：各0.5μL；10×Taq Buffer ：1μL；25mmol/L MgCl₂：1μL；10mmol/L dNTPs：1μL ；5U/μL Taq酶：0.1μL)。PCR 扩增反应程序为：94℃预变性5min；然后，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，进行30个循环；最后，72℃延伸10min。PCR 产物通过8％聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子量大小分离，电泳条件为80W 3h。凝胶组分为：8% 变性聚丙烯酰胺溶液60mL，TEMED50μL,10% 过硫酸胺500μL； 1×TBE 缓冲液电泳3h；染色过程是：10%冰醋酸溶液固定20min，超纯水迅速水洗，0.2%硝酸银溶液银染30min，再次迅速水洗，显影液显色直至条带清晰，10%冰醋酸溶液终止5min，超纯水再次水洗；凝胶中有带或无带分别记录为1或0。

（2）计算每对引物的多态性信息含量，利用popgene32 软件(Yeh F C, Yang R C, Boyle T. Popgene Version 1.31 Quick User Guide. Canada: University of Alberta and Centre for International Forestry Research, 1999: 1-29.)对步骤（1）所示的材料进行遗传多样性的分析，主要包括：观测等位基因Na，有效等位基因数Ne、观察杂合度Ho，期望杂合度He。

（3）具体结果为：在对60个玉米纹枯病菌材料进行遗传多样性分析时，8对引物具有多态性，共扩增41对等位基因，如图3。每个位点检测到的等位基因数（Na）为3个-8个，平均等位基因数5.13个；有效等位基因数（Ne）最高的位点为MA1（3.38），最低的位点为1.41（MA3），平均值为2.16；观测杂合度（Ho）的最小值为0.31（MA14），最大值为1.50（MA10），平均值为0.90；期望杂合度（He）的最小值为0.06（MA1），最大值为0.70（MA10），平均值为0.41（表2）。8对引物为MA1、MA3、MA4、MA8、MA10、MA11、MA12和MA14。

表2 玉米纹枯病菌微卫星位点的等位基因数和杂合度

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水稻研究所

<120> 一种玉米纹枯病菌SSR标记及其制备方法、应用

<130> 1

<160> 33

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tgccgcttca gctgctgc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gccccgcaac cctccatt 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

cggtgccccg atgttgag 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ccctcggttt tgatgttt 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

caatgccgcc ctccaaaa 18

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

cggtggatgc gttcaactt 19

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

tcgaaaactc atcaccaagc a 21

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

cccgacccga tgtccact 18

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

tgctgctgag actgttgttg 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gcctggtgcc atgtatttt 19

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gcctgctact cttcctcctc c 21

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

gccgtcgttg ctgttgttgt 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

ggctaaggct aaggcacagg 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

aactccgagt ccgaatcca 19

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

taagcctata agcctcatca 20

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

ggcggctggt aggtctgt 18

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

tgattccgag gcgtcttc 18

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

cgaaactgag gctataccag ac 22

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

agcatgattc tcatttgt 18

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

gtaagaggca aggtaaaa 18

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

ccacctcgtt ccaatcaca 19

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

accgccctct tcctcaca 18

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

cgtcgcaagg ccattgaa 18

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

tccgagtccg aatccact 18

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

tcgagttcga cctgtcgcag agtca 25

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

tgactctgcg acaggtcgaa ctcga 25

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

tcgaaaactc atcaccaagc a 21

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 28

cccgacccga tgtccact 18

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 29

ggccagagac cccaagcttc g 21

<210> 30

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 30

ccggtctctg gggttcgaag cctag 25

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 31

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 32

gagcggataa caatttcaca cagg 24