大豆低温诱导型启动子、包含该启动子的重组表达载体及应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及大豆基因启动子序列在低温胁迫下可以作为启动子调控基因的表达。

背景技术：

大豆是重要的经济作物，在世界范围内普遍种植，不仅是人类蛋白和脂类的主要来源，同时也是重要的家畜饲料和工业原料，在医学上也有很大价值。然而低温、干旱、高盐等不利环境条件会对大豆的生长和发育产生影响，从而导致大豆产量降低，造成严重的经济损失。除了常规育种技术，近年来随着分子生物学的发展和植物基因工程育种技术的成熟，应用基因工程方法改良大豆抗逆性成为可能。

启动子是DNA分子上位于结构基因上游，结合RNA多聚酶从而启动结构基因转录的一段DNA序列。基因表达效率主要取决于启动子的活性，高水平的表达内源或外源基因需要有高效的启动子。在基因工程中，目前常用CaMV35S等一些组成型启动子来控制目的基因的表达。这些启动子虽然能使目的基因过量表达，但它们是无组织、无环境、无时间特异性的组成型表达。利用组成型启动子控制抗逆相关基因的表达虽然可以提高植物在逆境条件下的抗逆能力，但即使在植物正常情生长情况下相关抗逆蛋白也会过量表达，这对植物代谢来说是一种浪费。并且正常环境下植物体内抗逆蛋白的长时间过量积累也会对植物的正常生长产生负面影响，引起转基因植物形态发生异常，生长延缓甚至是死亡。而逆境诱导启动子仅在植物遭受逆境胁迫时才大量启动下游基因的表达，可以避免外源基因在转基因植物中持续表达所引起的植物生长缺陷。因此克隆并应用逆境诱导型启动子，可以实现高效、可控和特异(定点、定时、定量)的调控抗逆基因的表达，在改良植物的抗逆性方面具有极大的优越，成为当前研究的热点。

目前国内外存在一些有关低温诱导启动子的报道。例如拟南芥rd29A启动子可以被低温、干旱和高盐等非生物胁迫诱导，是目前抗逆基因工程中应用最广泛的诱导型启动子。从冬麦中获得受低温诱导的blt101.1启动子。从野生稻中克隆出且具有低温诱导表达特性的冷诱导启动子p-LTT1。从水稻品种日本晴中获得低温强诱导启动子POscold6，该启动子能够特异的驱动外源基因在低温/冷胁迫条件下在植物中表达。但总的来说，目前能在基因工程中应用的低温诱导型启动子仍然不多，因此，对有效的新的低温诱导型启动子的克隆及研究仍然是今后研究的重点。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决有效的大豆低温诱导型启动子未被研制出来的问题，而提供了大豆低温诱导型启动子、包含该启动子的重组表达载体及应用。。

本发明的启动子来源于大豆乙烯响应因子基因GmERF9的启动子序列，命名为GmERF9P，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

所述的序列中含有多种与胁迫相关的顺式作用元件。

包含大豆低温诱导型启动子的重组表达载体，其重组表达载体的原始载体为pCAMBIA1301。

本发明的大豆低温诱导型启动子在低温下诱导抗寒基因表达中的应用。

本发明利用实时荧光定量PCR技术检测大豆叶片中GmERF9基因在4℃处理2h时的表达量，此时GmERF9的表达量显著升高，证明GmERF9基因具有低温诱导表达特性。因此，在大豆基因组数据库中搜索GmERF9基因上游大概2000bp序列，设计引物，从大豆叶片基因组中克隆出1885bp的GmERF9启动子序列，命名为GmERF9P。将GmERF9P构建到植物表达载体pCAMBIA1301上，通过叶盘法转化烟草。通过潮霉素筛选和PCR鉴定，获得T₁代阳性转基因烟草。对转基因烟草进行低温处理2h。对未处理烟草及低温处理烟草进行GUS组织化学染色和实时荧光定量PCR检测GUS基因的表达量，表明GmERF9P在低温胁迫下具有低温诱导启动特性，为低温诱导型启动子。

本发明相对于现有技术的优点：

利用组成型启动子控制抗逆相关基因的表达虽然可以提高植物在逆境条件下的抗逆能力，但即使在植物正常情生长情况下相关抗逆蛋白也会过量表达，这对植物代谢来说是一种浪费。并且正常环境下植物体内抗逆蛋白的长时间过量积累也会对植物的正常生长产生负面影响，引起转基因植物形态发生异常，生长延缓甚至是死亡。而逆境诱导启动子仅在植物遭受逆境胁迫时才大量启动下游基因的表达，可以避免外源基因在转基因植物中持续表达所引起的植物生长缺陷。本发明克隆了一个大豆低温诱导型启动子，该启动子的获得为植物抗寒基因工程研究提供有利工具，可在低温条件下启动抗寒相关基因的高效表达，从而培育出实用有效的抗寒植物品种。

附图说明

图1 GmERF9基因在低温处理0h和2h时表达量的实时荧光定量PCR检测结果；

图2 GmERF9基因启动子序列的PCR扩增结果，其中M为DL2000Marker，1为扩增条带；

图3 GmERF9P启动子序列顺式作用元件预测分析；

图4重组载体pCAMBIA1301-GmERF9P的质粒双酶切结果，其中M为DL2000Marker，1-3为双酶切条带；

图5 GmERF9P T₁代阳性转基因烟草PCR鉴定结果，其中M为DL2000Marker，1-6为T₁代阳性转基因烟草扩增条带，7为野生型烟草阴性对照，8为pCAMBIA1301-GmERF9P质粒阳性对照；

图6未处理野生型烟草叶片GUS组织化学染色结果；

图7低温处理2h野生型烟草叶片GUS组织化学染色结果；

图8未处理T₁代转基因烟草叶片GUS组织化学染色结果；

图9低温处理2h T₁代转基因烟草叶片GUS组织化学染色结果；

图10 GUS基因在转基因烟草中低温处理2h时表达量的实时荧光定量PCR检测结果，其中1为未处理T₁代转基因烟草中GUS基因表达量，2为低温处理2h时T₁代转基因烟草中GUS基因表达量，3为阳性对照pCAMBIA1301转基因烟草中GUS基因表达量。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意合理组合。

具体实施方式一：本实施方式的大豆低温诱导型启动子的序列如序列表中SEQ IDNO：1所示。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是，所述的序列中含有与胁迫相关的顺式作用元件。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是，所述顺式作用元件分别为GT-1、BIHD10S、WRKY、MYB、MYC和G-box。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式的包含大豆低温诱导型启动子的重组表达载体。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是，所述重组表达载体的原始载体为pCAMBIA1301。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式六：本实施方式大豆低温诱导型启动子在低温下诱导抗寒基因表达中的应用。

实施例1：本实施例将从以下实验对本发明的大豆低温诱导型启动子的序列进行验证：

(一)低温处理下GmERF9基因表达量的实时荧光定量PCR检测

将正常条件下盆栽的四叶期大豆幼苗置于4℃培养箱中进行低温处理，在处理0h和2h时，分别剪取0.1g叶片迅速置于液氮中，-80℃保存备用。采用Plant RNAzol试剂(购自北京鼎国生物技术公司)提取大豆低温处理及未处理时叶片总RNA，按照cDNA第一链合成试剂盒(购自北京鼎国生物技术公司)的说明书合成第一链cDNA。

根据GmERF9基因(GenBank登录号：AK245092)cDNA序列设计实时荧光定量PCR引物(F:5′-CATACCAACCTTCAAATGCCTC-3′；R:5′-TTTCTATTAGGGTCACGGATTTC-3′)。在BIO-RAD CFX96Real-Time PCR仪上，以大豆组成型表达基因β-Tubuin(GenBank登录号：GMU12286)作为内参基因(F:5′-GGAAGGCTTTCTTGCATTGGTA-3′；R:5′-AGTGGCATCCTGGTACTGC-3′)，以大豆叶片cDNA为模板。反应体系为2×SYBR Premix Ex Taq(购自TaKaRa公司)10μL、ROX Reference Dye II 0.2μL、cDNA 2μL、Primer F 0.4μL、Primer R 0.4μL，补水至总体积20μL。反应程序：95℃预变性10s；95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸30s，40个循环。各处理均做3次重复计算基因的相对表达量。试验结果利用BIO-RAD CFX Manager软件进行数据分析。如表1和图1所示，结果表明GmERF9基因在低温处理2h时表达量显著升高。

表1低温处理下GmERF9基因的相对表达量(数值为三次重复平均值)

(二)GmERF9基因启动子序列的克隆及顺式作用元件分析

根据大豆GmERF9基因cDNA序列搜索大豆基因组数据库GmGDB(http：//www.plantgdb.org/GmGDB/)，获得其上游大概2000bp的启动子序列。利用引物设计软件Primer5设计引物，序列如下，F：5'-ACGCGTCGACCCGTGCAACTTGATATTCGT-3'(下划线代表SalⅠ酶切位点)；R：5'-GGCCATGGTTTTTGGTTGTGAAATTGAGG-3'(下划线代表NcoⅠ酶切位点)。采用植物基因组DNA提取试剂盒(购自北京鼎国生物技术公司)提取大豆叶片基因组DNA，以基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR程序：94℃8min；94℃40s，56℃40s，72℃1min，进行30个循环；72℃延伸8min。得到的扩增条带如图2。将上述扩增片段回收后与克隆载体pMD18-T(购自TaKaRa公司)进行连接，将筛选获得阳性质粒命名为pMD18-T-GmERF9P，并送上海生工公司进行测序，验证序列正确。PLACE(http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)数据库用于启动子顺式作用元件的预测分析。

经PCR扩增得到GmERF9基因启动子序列GmERF9P，长度1885bp(如序列表中SEQ ID NO：1所示)。经预测GmERF9P序列含有多种与逆境相关的顺式作用元件，由图3可以看出与逆境相关的顺式作用元件包括3个GT1元件，1个G-box元件，2个BIHD10S结合位点，5个WRKY结合位点，3个MYB结合位点和1个MYC结合位点。将GmERF9P序列在NCBI数据库中进行同源性Blast，没有得到与其具有同源性的启动子序列，表明GmERF9P是一个新的启动子序列。

(三)GmERF9P的烟草转化及转基因烟草鉴定

植物表达载体构建方法：

用SalⅠ和NcoⅠ两种限制性内切酶(各种限制性内切酶均购自TaKaRa公司)双酶切pMD18-T-GmERF9质粒，将酶切产物经琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒(购自北京鼎国生物技术公司)纯化后，与同样用SalⅠ和NcoⅠ双酶切的pCAMBIA1301载体(目的是切除CaMV35S启动子)连接，得到pCAMBIA1301-GmERF9P。连接产物转化大肠杆菌DH5α(购自北京鼎国生物技术公司)，质粒经双酶切验证后(结果如图4所示)，转化农杆菌EHA105(购自Biovector公司)。

利用农杆菌侵染烟草叶盘法将pCAMBIA1301-GmERF9P转化烟草NC89(购自中烟种子有限公司)，同时转化pCAMBIA1301空载体作为阳性对照。具体方法如下：

1将烟草种子置于1.5mL离心管中，用10％的次氯酸钠浸泡消毒3min，无菌水冲洗4-5次；

2将烟草种子铺于MS培养基上，培养条件：16h(28℃)光照/8h(22℃)黑暗；

3取萌发后生长1-2个月的无菌烟草叶片，将其剪成0.5cm²的小块(去掉主脉)，并接种于MS分化培养基上(MS添加3mg/L 6-BA和0.2mg/L NAA)，预培养2天；

4挑取pCAMBIA1301-GmERF9P单克隆于5mL附加50μg/mL利福平和50mg/L卡那霉素的YEP(蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、NaCl 5g/L)中，28℃，120rpm振荡培养24h；

5按1：100的比例将上述培养物转入50mL附加50μg/mL利福平和50μg/mL卡那霉素的YEP中，28℃，120rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.4-0.5；

6 5000rpm，室温下离心15min，去除上清，将菌体重悬于MS液体培养集中，至OD₆₀₀＝0.5左右；

7将预培养后的烟草叶片在重悬液中侵染20min，吸干叶片表面的菌液，置于共培养基上(PH至调至5.4左右)，共培养3天；

8将共培养后的烟草叶片用含500mg/L羧苄青霉素的MS液体培养基清洗，晾干后转移到筛选培养基上(MS添加3mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、500mg/L羧苄青霉素和8mg/L潮霉素)，每15天继代一次；

9待抗性芽长到1cm时，移入生根培养集中(MS添加200mg/L羧苄青霉素和5mg/L潮霉素)，促其长根；

10待烟草苗根系发育好后，移入土中，常规管理。

转基因烟草的筛选及鉴定方法：

1取T₀代烟草叶片，按照Universal Genomic DNA Extraction Kit(购自TaKaRa公司)说明书中的方法提取叶片总DNA；

2将提取的DNA稀释50倍后，取1μL为模板，用引物(F：5'-CCGTGCAACTTGATATTCGT-3'；R：5'-TTTTTGGTTGTGAAATTGAGG-3')进行常规PCR验证。其中以未转化的野生烟草为阴性对照，质粒pCAMBIA1301-GmERF9P为阳性对照；

3收获阳性烟草植株的种子，即T₁代种子；

4将T₁代种子种入土中获得T₁代烟草苗，对其继续提取DNA进行PCR检测，取T₁代阳性烟草植株进行后续抗性鉴定试验。

图5为GmERF9P在部分T₁代转基因烟草中的PCR鉴定结果，表明GmERF9P启动子已经成功整合到烟草基因组中。

(四)转基因烟草低温处理下叶片GUS组织化学染色

将正常盆栽培养的6周大T₁代转基因烟草置于4℃培养箱中进行低温处理。剪取未处理的T₁代转基因烟草叶片和低温处理2h的T₁代转基因烟草叶片，同时剪取未处理和低温处理2h的野生型烟草叶片作为阴性对照，进行GUS组织化学染色：加入GUS染色液(大豆硬脂酸-ACP脱饱和酶基因启动子的克隆及其表达活性分析，张庆林等，2011)，于37℃温育过夜，用75％的乙醇脱色至底色完全消失。

GUS组织化学染色结果如图6-9所示，未处理和低温处理2h的野生型烟草叶片没有被染成蓝色；未处理的T₁代转基因烟草叶片被染成浅蓝色，但着色较浅，表明GmERF9P具有启动子的启动活性；低温处理2h的T₁代转基因烟草叶片被染成蓝色且着色较深，表明GmERF9P的启动活性在低温处理2h时被诱导，使下游报告基因GUS的表达量增高。

(五)转基因烟草低温处理下GUS基因表达量的实时荧光定量PCR检测

将正常盆栽培养的6周大T₁代转基因烟草置于4℃培养箱中低温处理2h。剪取低温处理2h和未处理的T₁代转基因烟草叶片0.1g，同时剪取pCAMBIA1301T₁代转基因烟草叶片作为阳性对照，迅速置于液氮中，-80℃保存备用。采用Plant RNAzol试剂(购自北京鼎国生物技术公司)提取烟草叶片总RNA，按照cDNA第一链合成试剂盒(购自北京鼎国生物技术公司)说明书合成第一链cDNA。

在BIO-RAD CFX96Real-Time PCR仪上，以烟草组成型表达基因α-tubulin(GenBank登录号：AB052822)作为内参基因(F：5′-ATGAGAGAGTGCATATCGAT-3′；R：5′-TTCACTGAAGAAGGTGTTGAA-3′)，GUS基因实时荧光定量PCR引物如下，F：5′-GATCGCGAAAACTGTGGAAT-3′；R：5′-TAATGAGTGACCGCATCGAA-3′。以烟草叶片cDNA为模板。实时荧光定量PCR反应体系和反应程序同上，退火温度改为55℃。如图10和表2所示，实时荧光定量PCR结果表明GmERF9P在低温处理2h时可以明显提高下游报告基因GUS的表达量。

表2转基因烟草低温处理下GUS基因的相对表达量(数值为三次重复平均值)