本发明涉及一种细胞复苏试剂，具体涉及一种新型的细胞复苏试剂，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：细胞冻存使用的冻存试剂有含血清和无血清两类，由于血清具有成分复杂、质量不稳定、价格昂贵等缺点，所以无血清冻存和复苏技术成为发展的趋势。本发明主要是针对无血清冻存和复苏技术进行的研究。对细胞进行冻存操作时，一般是将细胞悬浮在冻存试剂中，然后采用梯度降温的方法降温，降温速度大约是1℃/min。对冻存的细胞进行复苏时，一般是将冻存管直接置于37℃迅速解冻，然后加入完全生长培养基重悬细胞，离心弃上清后，再加入完全生长培养基继续培养，以供后续的研究或测试使用。结合上述无血清冻存和复苏技术对细胞进行冻存和复苏，细胞冻存后复苏率远低于含血清的冻存技术。所以，一些细胞复苏试剂应运而生。但是，现有的细胞复苏试剂还存在以下两方面的问题：一、通用性较差，一种复苏试剂只适用于一种细胞，或者只适用于少数几种相似的细胞；二、细胞复苏后，复苏成活率(复苏率)较低，并且活性较差。技术实现要素：为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新型的细胞复苏试剂，其不仅可以提高细胞复苏率，而且还具有较好的通用性。为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：一种新型的细胞复苏试剂，其特征在于，各组成成分及用量分别为：本发明的有益之处在于：(1)不含动物成分，使用安全可靠；(2)成分完全明确，便于质量控制；(3)即用型，操作更加方便；(4)适用的细胞类型不限；(5)可以在细胞复苏时获得更好的复苏率。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。一、准备各相关试剂表1各组的组成成分及用量在本发明的复苏试剂中，我们选用重组人血白蛋白，并将重组人血白蛋白与RPMI-1640培养基按照2:8的体积比混合，不含血清等动物成分，使用安全可靠。此外，为了更好的保持复苏细胞的活性，我们经反复验证，最后选定了重组人表皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子和维生素D作为补充成分，为验证最合适的因子浓度，我们进行了上述组分的不同组合，以便验证具体的复苏效果。二、制备方法准备RPMI-1640培养基(购自美国Life公司)、重组人血白蛋白(购自武汉禾元生物)、重组人表皮生长因子(购自美国Peprotech公司)、重组人碱性成纤维细胞生长因子(购自美国Peprotech公司)、维生素D(购自美国Sigma公司)。在百级的无菌操作台里进行相关试剂的配制。重组人表皮生长因子和重组人碱性成纤维细胞生长因子的配制按照厂家的说明书进行操作。三、使用方法取出冻存管，立即置于37℃水浴锅中进行细胞复苏，解冻过程中注意轻轻摇动冻存管，以保证解冻完全。50-60s左右，当冻存管中已无冰块，从水浴锅中取出冻存管，在无菌操作台中加入等体积的细胞复苏试剂，将所有液体转移至15ml离心管中，于37℃二氧化碳培养箱中静置3min，再加入完全生长培养基继续培养，以供后续的研究或测试使用。四、复苏效果选用人Hela细胞进行试验。收集足量的人Hela细胞，用冻存试剂进行细胞重悬，将符合密度要求(3×106/ml)的细胞装入冻存管。使用程序梯度降温仪给冻存管进行降温，之后转入-196℃液氮环境。冻存一周后，取出冻存管进行细胞复苏，观察各组细胞的复苏情况，并计算各组细胞的复苏成活率(简称复苏率)。1、人Hela细胞的形态学观察冻存一周，使用本发明的细胞复苏试剂进行复苏，应用相差显微镜来观察复苏后各组细胞的存活及分化情况，培养3天后计算克隆形成率。实验组：使用表1中的复苏试剂根据上述的细胞复苏方法进行复苏。对照组：将冻存管直接置于37℃水浴锅中迅速解冻，然后加入完全生长培养基重悬细胞，离心弃上清后，再加入完全生长培养基继续培养。应用相差显微镜来观察复苏后各组细胞的存活及分化情况，观察结果显示：(1)实验组：人Hela细胞继续培养后，生长状态良好，形态正常，无悬浮的死细胞。(2)对照组：人Hela细胞继续培养后，生长状态一般，有部分悬浮的死细胞。培养3天后计算克隆形成率，计算结果显示：经计算，各组细胞的克隆形成率见表2。表2各组细胞的克隆形成率克隆形成率第1组5％第2组10％第3组50％第4组75％第5组90％第6组60％第7组65％第8组50％第9组45％2、人Hela细胞的复苏率测定冻存一周，然后复苏，计算各组细胞的复苏率。实验组：使用表1中的复苏试剂进行复苏。对照组：将冻存管直接置于37℃迅速解冻，然后加入完全生长培养基重悬细胞，离心弃上清后，再加入完全生长培养基重悬，去细胞样品进行复苏率的测定。计算结果见表3。表3各组细胞的复苏率细胞复苏率第1组88％第2组90％第3组89％第4组91％第5组98％第6组95％第7组93％第8组92％第9组94％对照组90％以上试验结果说明：本发明的细胞复苏试剂不仅可以很好的保持细胞的形态学特征，而且能够提高细胞的复苏率。本发明的细胞复苏试剂，通过添加2种因子(重组人表皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子)和1种维生素(维生素D)，并结合重组人血白蛋白，可以实现细胞复苏后，无需离心去除冻存试剂中的DMSO，可以直接进行后续的细胞培养，同时能够保证细胞具有较高的复苏率(即具有较高的活性)。五、适用的细胞类型选用PBMC细胞、MSC细胞、CIK细胞、NK细胞、293细胞、HUVEC细胞、成纤维细胞、人ES细胞、人iPS细胞共计9种不同类型的细胞进行试验。选用第5组复苏试剂。各组细胞冻存一周后，采用与第四步相同的试验方法进行试验。试验结果见表4。表4针对不同类型的细胞复苏试剂的复苏效果细胞名称细胞特性细胞复苏率PBMC细胞细胞形态正常88％MSC细胞细胞形态正常97％CIK细胞细胞形态正常95％NK细胞细胞形态正常93％293细胞细胞形态正常99％HUVEC细胞细胞形态正常89％成纤维细胞细胞形态正常100％人ES细胞细胞形态正常86％人iPS细胞细胞形态正常88％由表4可知：对于不同类型的细胞，使用本发明的细胞复苏试剂复苏后，细胞形态正常，细胞复苏率(活性)较高。以上试验结果说明：本发明的细胞复苏试剂复苏效果很好，并且适用的细胞类型不限，通用性强。需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。当前第1页1 2 3