本发明属于生物质乙醇及绿原酸系列产品的生产技术领域，具体涉及金属与酶共催化活化金银花叶生产生物质乙醇并提制绿原酸及其绿原酸异构体的方法。
背景技术：
可再生资源生产燃料乙醇是针对全球化石燃料短缺、能源成本增加以及与减少碳排放的有效解决方案之一；而生物质以其丰富的碳素资源，是唯一可以转化为液体燃料的可再生能源。生物质主要包含纤维素、半纤维素、木质素等，将其转化合成乙醇最大的技术难题在于天然结晶纤维素的降解，而生物质中高医药活性的天然产物的提取也受限于纤维组织的致密结构。因此，研究木质纤维素的催化水解条件、有效提高生物质能转化及天然活性成分提取的方法，具有非常重要的意义。
金银花在我国各省均有分布，其纤维素、半纤维素和木质素含量分别为9.24%，3.44%和10.37% ，可用于生物质燃料乙醇的开发。其次，金银花叶还含有绿原酸4.8%，以及绿原酸的异构体，如新绿原酸、隐绿原酸等，这些天然活性成分具有良好的抗氧化性、抗突变及抗癌活性、降血糖、血脂、血压活性以及保护心血管及中枢神经等药效，广泛应用于人类医学中，具有广阔的应用前景。但绿原酸自身不稳定，高温、强光及长时间加热会导致其分解。因此，研究高效的植物组织水解方法，确保天然产物的生物活性的同时，提高生物质资源的利用率，具有现实的经济效应。
现有催化水解植物组织的方法，如2015年6月24日公开的公开号为CN102241565A的“一种纤维素废弃物生物制备乙醇并联产壳聚糖的方法”， 公开的方法是：纤维素废弃物经0.5-1.0% 的硫酸溶液浸泡2-4 h，1.5-2.2 MPa蒸汽爆破1-15 min、水洗过滤得固体渣和预水解液，固体渣经纤维素酶（纤维素酶用量为10-40 FPU、β- 葡萄糖苷酶用量3-20 U）于45-55 ℃条件下酶解糖化反应36 h以上后，加入酿酒酵母于28-30 ℃下发酵12-24h；预水解液中和至pH 值6.0-7.0 后作为培养基，于25-40℃培养米根霉24 h，获得富含壳聚糖的米根霉菌体，从而提取壳聚糖。该方法的主要缺点是：（1）该方法水解纤维素采用0.5-1.0% 的硫酸溶液，且浸泡2-4 h，生产过程中使用环境污染的硫酸，加大环境治理成本，进而增加生产成本。（2）该方法预处理时采用蒸汽爆破处理纤维素废料，其蒸汽爆破压力为1.5-2.2 MPa ，在生产过程中的加压技术，增加生产的不安全隐患，进一步增加生产成本。（3）采用纤维素酶酶解糖化，其酶解糖化温度为45-55 ℃，酶解糖化时间为36 h，45-55 ℃的生产条件，需外加能源，且纤维素酶糖化36 h，不仅影响酶活性，降低生物质的糖化效率，且耗时长，增加生产时间和设备占有，进而增加生产成本。（4）该方法采用纤维素酶糖化与酿酒酵母发酵的工艺，且预处理时除使用酸外，还使用蒸汽爆破处理，故涉及多个生产设备和生产工艺，增加了生产的技术控制和生产设备的场地占用，进而增加生产成本。基于2015年11月25日获得授权的专利号为ZL103086889B的“一种酶催化活化金银花叶提取绿原酸的方法”，其主要方法是选用纤维素酶和木质素酶为复配酶，在pH值为4的、40℃水浴条件下催化水解11h后提取金银花叶中绿原酸。该方法存有的不足是：（1）该方法金银花叶中其他活性成分及其纤维组织未充分利用，未能提高生物质金银花叶原料资源利用率；（2）该方法选用复配酶虽能有效降解纤维素和木质素，具有强水解能力，但酶催化时间仍需要11小时，酶活性需提高；（3）该方法纤维素酶和木质素酶为复配酶，其催化水解适宜pH值为4，即酸性条件，易造成生产设备的腐蚀，进而增加设备生产成本。
技术实现要素：
本发明的目的是，针对现有生物质生产乙醇方法以及金银花叶提制绿原酸的不足，提供一种金属酶催化活化金银花叶生产乙醇并提制绿原酸及其异构体的方法，具有生产条件温和（常温常压）、操作简单、未使用酸碱性活化剂、有机溶剂使用量少、生产能耗低、绿原酸溶浸充分且稳定、生物质利用充分等特点。
本发明的机理是：本发明以金银花叶为原料，选用工程酶（纤维素酶、漆酶和木聚糖酶）作为催化活化木质纤维素的酶制剂、锰系催化剂为酶制剂的激活剂，通过金属催化剂提高酶制剂中纤维素酶、漆酶和木聚糖酶的催化活性，促使木聚糖酶和漆酶降解金银花叶中桎梏纤维素的木质素，增强纤维素酶对纤维素的水解作用，从而减少金银花叶植物纤维组织对绿原酸溶出的阻碍作用，提高绿原酸提取率和产品品质；并利用管囊酵母和酿酒酵母发酵，将水解糖化获得的还原糖发酵成乙醇。酶制剂和金属激活剂二者协同催化水解金银花叶植物纤维组织，因酶催化具有专一及条件温和等特点，避免了高温、强光及长时间加热破坏绿原酸产品的稳定性，有利于提高绿原酸品质；同时，金银花叶预处理采用金属激活剂和酶制剂代替化学活化剂硫酸，不仅避免了蒸汽爆破引起的生产安全隐患，而且也避免了化学活化剂硫酸或碱的使用，减少对环境造成的二次污染。此外，将催化、糖化、发酵三工艺（CSSF）结合并同时在一个反应罐内进行，实现乙醇的生产以及天然活性成分的提取，节省了反应时间，简化了反应设备，有利于环境保护，有助于金银花叶等生物质资源化再利用的生产及推广。
实现发明目的的技术方案是：一种金属-酶共催化金银花叶产生物质乙醇及提取绿原酸的方法，以金银花叶固体废弃物为原料，经原料预处理、酶解反应、超声波处理、绿原酸产品制备、副产物烟碱提取的简单工艺而得到产品。所述方法的具体步骤如下：
（1）金属激活剂的制备
以化学试剂MnSO4·H2O、FeCl3·6H2O、ZnSO4·7H2O为原料，先按MnO、ZnO、Fe2O3的摩尔比为2∶3∶5～4∶1∶5配制成原料液加入反应釜，再缓慢加入与原料液摩尔比为1.0～2.0倍的沉淀剂，并在40～80℃水浴中充分搅拌20～50min。然后滴加NaOH溶液调节pH值至6.5～10，继续搅拌20～60min后，放于室温自然陈化10～14h，经抽滤、洗涤、烘干，得前躯体。最后将前驱体置于1000～1300℃马弗炉煅烧2～6h，自然冷却至室温后取出，即得酶激活剂锰锌铁氧体。所述的沉淀剂为NH4HCO3、（NH4）2CO3、NaOH、H2CO3等。
（2）酵母液培养
第（1）步骤完成后，以酿酒酵母和管囊酵母为发酵菌种，分别经过斜面培养、一级种子试管培养后，先按重量比为1∶1～3将两菌种接种入摇瓶培养，将培养好的菌种接入装液量为60 ml的250 ml三角瓶中，接入量为2～8%，并在25～35℃混合培养36～60h，得酵母液。
（3）原料预处理
第（2）步骤完成后，以金银花叶（包括金银花叶加工过程中的下脚料及提取金银花叶中天然产物的固体废渣以及其他生物质废渣等）为原料。先将原料用水清洗干净后，放置于85～110℃的烘箱中烘30～90min，再经粉碎机粉碎后过20～160目筛，未过筛的原料返回粉碎机中再粉碎，收集过筛原料，即为预处理后的生物质原料。
（4）共催化同步酵解
第（3）步骤完成后，先按照第（3）步处理后的生物质原料质量 (g)∶复合催化剂质量(g)∶酵母液（ml）∶水的体积(ml)之比为1∶0.1～0.6∶0.5～2∶5～15，混合均匀后放置于摇床中，在水浴温度为35～60℃下进行酵解活化2～10h后，用抽滤泵进行抽滤，分别收集滤液和固体滤渣。收集的滤液为含乙醇及其绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸的水相提取液；收集的滤渣为经金属催化、酶糖化、酵母发酵处理后的金银花叶废弃物。所述的复合催化剂为金属酶激活剂和复配酶的金属-酶制剂；所述的金属酶激活剂为锰锌铁氧体（MnZnFeO）或Mn或Fe，其投加质量（g）为0.01～0.1；所述复配酶酶活比为纤维素酶(U)∶漆酶(U)∶木聚糖酶(U)=51～64∶23～47∶2～14的复配酶。
（5）绿原酸及乙醇的分析检测
第（4）步骤完成后，先将收集的滤液转入离心机中，在离心转速为2500～4000r/min条件下，进行离心分离5～15min后，分别收集离心清液（即为含绿原酸和乙醇的提取液）和离心渣；收集的离心渣与第（4）步骤中固体滤渣合并作为制备吸附材料的原料。接着将收集的离心清液用蒸馏水定容后，先取离心清液5～10ml，按照体积比为离心清液（ml）∶内标物正丙醇（ml）=5～10∶0.1～0.2加入内标物正丙醇，采用气相色谱法测定乙醇浓度，乙醇产品质量为乙醇质量 (mg)∶生物质原料质量 (g)=5.50～17.99∶1。再取离心定容后的离心清液2～5ml，采用高效液相色谱法测定金银花叶中绿原酸的含量，绿原酸溶出的质量浓度为0.054～0.102g/l，新绿原酸溶出的质量浓度为0.0327～0.0495g/l，隐绿原酸溶出的质量浓度为0.0110～0.0935g/l；最后将剩余离心清液置于旋转蒸发器中，在真空压强为0.1～0.6Mpa、温度为30～60℃下，进行减压浓缩至粘稠状得绿原酸粗制品，重复2～4次，制得绿原酸产品。绿原酸提取率高达90.9～98.2%，纯度高达85.0～92.0%。
本发明采用上述技术方案后，主要有以下效果：
（1）本发明选用金属催化剂、复配酶协同作为催化水解木质纤维素的活化剂，提高金银花叶内部通透性，减少绿原酸溶出传质阻力，提高绿原酸提取率的同时，经管囊酵母和酿酒酵母发酵获得乙醇，从而获得乙醇并提高绿原酸的提取率。因此，本发明方法所采用金属催化剂、复配酶与酵母三工艺同步催化水解发酵木质纤维素仅需8小时，大大缩短生产时间，所得乙醇质量浓度高达0.102g/l，绿原酸提取率高达98.2%。
（2）本发明选用金属作为酶激活剂，大大提高了复合酶制剂的催化活性，不仅增强了生物质植物纤维组织的水解糖化能效，降低了天然活性成分的传至阻力，而且也缩短生产时间。因此，本发明方法所用时间仅为8h，比2015年11月25日授权专利号为ZL103086889B的“一种酶催化活化金银花叶提取绿原酸的方法”中酶解11h缩短了3h。
（3）本发明选用的金属与酶协同催化代替乙醇生产或天然产物提取时的传统化学活化剂硫酸或碱，减少了酸碱等化学试剂对绿原酸生物活性的破坏，确保绿原酸生物活性保留完备，还避免酸碱对生产设备的腐蚀而缩短生产设备使用寿命，有利于环境保护，又降低生产成本，并且还避免了乙醇生产中使用蒸汽爆破带来的生产安全隐患，
（4）本发明方法的原料来源广，生产成本低，操作简单，方法绿色环保。本发明方法可广泛应用于固体金银花叶为原料提制绿原酸，也可广泛应用于从金银花叶中隐绿原酸、新绿原酸等的提取。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进一步说明。
实施例1
一种金属-酶共催化金银花叶产乙醇同时提制绿原酸的方法的具体步骤如下：
（1）金属激活剂的制备
以化学试剂MnSO4·H2O、FeCl3·6H2O、ZnSO4·7H2O为原料，先按MnO、ZnO、Fe2O3的摩尔比为3∶2∶5配制成原料液加入反应釜，再缓慢加入与原料液摩尔比为1.5倍的沉淀剂，于50℃水浴中，充分搅拌40min。所述的沉淀剂为NH4HCO3。然后滴加NaOH溶液调节pH值至7.1，继续搅拌40min后，放于室温自然陈化12h，经抽滤、洗涤、烘干，得前躯体。最后将前驱体置于1140℃马弗炉煅烧3.0h，自然冷却至室温后取出，即得酶激活剂锰锌铁氧体。
（2）酵母液培养
第（1）步骤完成后，以酿酒酵母和管囊酵母为发酵菌种，分别经过斜面培养、一级种子试管培养后，先按重量比为1∶1将两菌种接种入摇瓶培养，将培养好的菌种接入装液量为60 ml的250 ml三角瓶中，接入量为5%，并在29℃混合培养48h，得酵母液。
（3）原料预处理
第（2）步骤完成后，以金银花叶（包括金银花叶加工过程中的下脚料及提取金银花叶中天然产物的固体废渣以及其他生物质废渣等）为原料。先将原料用水清洗干净后，放置于100℃的烘箱中烘60min，再经粉碎机粉碎后过60目筛，未过筛的原料返回粉碎机中再粉碎，收集过筛原料，即为预处理后的生物质原料。
（4）共催化同步酵解
第（3）步骤完成后，先按照第（3）步处理后的生物质原料质量 (g)∶复合催化剂质量(g)∶酵母液（ml）∶水的体积(ml)之比为1∶0.4∶1∶10，混合均匀后放置于摇床中，在水浴温度为40℃下进行酵解活化8h。所述的复合催化剂为金属酶激活剂和复配酶的金属-酶制剂；所述的金属酶激活剂为锰锌铁氧体（MnZnFeO），其投加质量为0.04g；所述复配酶酶活比为纤维素酶(U)：漆酶(U)：木聚糖酶(U)=55∶10∶1的复配酶。然后用抽滤泵进行抽滤，分别收集滤液和固体滤渣。收集的滤液为含有绿原酸及乙醇的水相提取液；收集的固体滤渣为经金属催化、酶糖化、酵母发酵处理后的金银花叶废弃物。
（5）绿原酸及乙醇的分析检测
第（4）步骤完成后，先将收集的滤液转入离心机中，在离心转速为3000r/min条件下，进行离心分离10min后，分别收集离心清液（即为含绿原酸和乙醇的提取液）和离心渣；收集的离心渣与第（4）步骤中固体滤渣合并作为制备吸附材料的原料。接着将收集的离心清液用蒸馏水定容后，先取离心清液10ml，按照体积比为离心清液（ml）：内标物正丙醇（ml）=10∶0.2加入内标物正丙醇，采用气相色谱法测定乙醇浓度，乙醇产品质量为乙醇质量 (mg)：生物质原料质量 (g)=17.99：1。再取离心定容后的离心清液2ml，采用高效液相色谱法测定金银花叶中绿原酸的含量，绿原酸溶出的质量浓度为0.0956 g/l，新绿原酸浓度为0.0495g/l，隐绿原酸浓度为0.0581g/l；最后将剩余离心清液置于旋转蒸发器中，在真空压强为0.2Mpa、温度为50℃下，进行减压浓缩至粘稠状得绿原酸粗制品，重复2次，制得绿原酸产品。绿原酸提取率高达98.2%，纯度高达91.0%。
实施例2
一种金属-酶共催化金银花叶产乙醇同时提制绿原酸的方法，同实施例1，其中：
第（1）步中，MnO、ZnO、Fe2O3的摩尔比为4∶1∶5，沉淀剂NH4HCO3与原料液摩尔比为2.0倍，水浴温度为80℃，搅拌时间为60min。调节溶液pH值至10，继续搅拌时间为60min后，马弗炉煅烧温度为1300℃，煅烧时间为2.0h。
第（2）步中，酿酒酵母和管囊酵母重量比为1∶2，混合培养时间为48h。
第（3）步中，选用金银花叶目数为160目，烘箱温度为110℃，烘干时间为30min。
第（4）步中，生物质原料质量 (g)∶复合催化剂质量(g)∶酵母液（ml）∶水的体积(ml)之比为1∶0.6∶2∶55，水浴温度为60℃，酵解活化2h。所述的金属酶激活剂为锰锌铁氧体投加质量为0.01g；所述复配酶酶活比为纤维素酶(U)：漆酶(U)：木聚糖酶(U)=45∶20∶1的复配酶。
第（5）步中，离心清液（ml）：内标物正丙醇（ml）=5∶0.1加入内标物正丙醇，乙醇质量 (mg)：生物质原料质量 (g)=15.00∶1。绿原酸溶出的质量浓度为0.0608g/l，新绿原酸浓度为0.0374g/l，隐绿原酸浓度为0.0110g/l；真空压强为0.6Mpa、温度为30℃，绿原酸提取率达93.2%，纯度高达91.0%。
实施例3
一种金属-酶共催化金银花叶产乙醇同时提制绿原酸的方法，同实施例1，其中：
第（1）步中，MnO、ZnO、Fe2O3的摩尔比为2∶3∶5，沉淀剂NH4HCO3与原料液摩尔比为1.0倍。溶液pH值调节至6.5后，继续搅拌时间为20min后，马弗炉煅烧温度为1000℃，煅烧时间为6.0h。
第（2）步中，酿酒酵母和管囊酵母重量比为1∶3，混合培养时间为36h。
第（3）步中，选用金银花叶目数为20目，烘箱温度为85℃，烘干时间为90min。
第（4）步中，生物质原料质量 (g)∶复合催化剂质量(g)∶酵母液（ml）∶水的体积(ml)之比为1∶0.1∶0.5∶15，水浴温度为35℃，酵解活化10h。所述的金属酶激活剂为锰锌铁氧体投加质量为0.1g；所述复配酶酶活比为纤维素酶(U)：漆酶(U)：木聚糖酶(U)=60∶5∶1的复配酶。
第（5）步中，乙醇质量 (∶)：生物质原料质量 (g)=5.50∶1。绿原酸溶出的质量浓度为0.0523g/l，新绿原酸浓度为0.0342g/l，隐绿原酸浓度为0.0457g/l；真空压强为0.1Mpa、温度为60℃，绿原酸提取率达90.0=9%，纯度高达85.0%。
实验结果
1、不同条件催化糖化发酵金银花叶产乙醇的实验结果如下：
表1不同时间金属-酶共催化与复配酶催化金银花叶产乙醇的比较
表2 不同金属激活剂投加量产乙醇随时间的比较
2、不同条件催化提制绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸的实验结果如下：
表3 不同催化时间提制绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸
从上述实验知：本发明采用金属-酶共催化活化处理金银花叶，当投加与金银花叶质量比为1：0.04的复合催化剂（其中纤维素酶：漆酶：木聚糖酶酶活比为55∶10∶1，金属酶投加量为0.04g），加入水体积比为1：10，在水浴近室温条件下40℃，酶解时间为8h，可制得绿原酸产品，其绿原酸提取率可达98.2%，纯度可达91.0%；并在酿酒酵母和管囊酵母作用下，同时可获得乙醇，其乙醇含量为17.99mg/g。该方法利用金属激活剂提高酶活性，催化8h，绿原酸溶浸率可达98.2%，生产时间仅是复合酶浸提绿原酸（11h）的73%，大大缩短了生产时间，且绿原酸溶出充分。该方法用金属-酶制剂酶代替酸碱活化剂，不仅可获得绿原酸，同时还可获得乙醇，其生产条件温和，不仅避免酸碱对生产设备的腐蚀，而且减少高温高压制备产品的生产安全隐患，操作简单，产品生物活性完备，同时减少生产过程中酸碱及有害有机物对环境造成的二次污染，有利于环境保护，降低生产成本。