酪氨酸激酶抑制剂及其应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种酪氨酸激酶抑制剂及其应用。

背景技术：

蛋白激酶是一种磷酸转移酶，转移三磷酸腺苷atp的伽马磷酸脂基到特定的氨基酸残基，用以实现蛋白的磷酸化，从而实现其生理和生化功能。

蛋白激酶在信息传导上有着重要功能。反常的蛋白激酶不能进行正常的信号传递，可能会引起病变，例如：肿瘤细胞增生、细胞死亡、炎症、心血管疾病等蛋白激酶。蛋白激酶主要分为两类：蛋白酪氨酸激酶ptks和受体酪氨酸激酶rtks。met族蛋白激酶中的ros1/c-met是rtps的一个重要亚系，也称作hhgfr和ron；ros1/c-met能够对起始肿瘤细胞的生长和代谢起到重要作用，是多种药物临床研究的目标靶点。

因此，生物医疗技术领域急需ros1/c-met激酶抑制剂，尤其是小分子化合物的酪氨酸激酶抑制剂。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种酪氨酸激酶抑制剂，该激酶抑制剂能够抑制c-met、vegf、kdr、ron、kit、pdgf、fgf、src等多种参与信号传导的酪氨酸激酶的活性，能有效抑制肿瘤细胞的增殖，使临床癌症治疗取得更好效果。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种具有通式(i)的盐类化合物，

其中，

r1选自卤素、卤素负离子、低级卤代烷烃基、低级烷烃基、低级烯烃基、低级炔烃基、取代饱和或不饱和环烷基，取代或不取代芳香烷基、取代或不取代芳香基、取代或不取代杂环基、取代或不取代杂环烷基、或为空；

y选自c、o、n、s或为空；

x选自碳酸根、硫酸根、亚硫酸根、硫酸氢根、磷酸根、亚磷酸根、磷酸氢根、磷酸二氢根、钼酸根、氯酸根、或为空。

优选的，所述通式(i)化合物包括下述具体结构的化合物：

在本发明的另一方面，还提供了一种药物组合物，该组合物包含安全有效量的上述化合物和药学上可接受的载体。

上述可接受的载体是无毒的、能辅助施用并且对化合物的治疗效果没有不利影响。此类载体可以是本领域的技术人员通常能得到的任何固体赋形剂、液体赋形剂、半固体赋形剂或者在气雾剂组合物中的气体赋形剂。固体药物赋形剂包括淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、甘油硬脂酰酯、氯化钠、无水脱脂乳等。液体和半固体赋形剂可以选自甘油、丙二醇、水、乙醇和各种油，包括那些源于石油、动物、植物或人工合成的油，例如，花生油、豆油、矿物油、芝麻油等、优选的液体载体，特别是用于可注射溶液的，包括水、盐水、葡萄糖水溶液和甘醇。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明的化合物以治疗上的有效量施用，其施用方式可以是口服、全身施用(例如，透过皮肤的、鼻吸入的或者用栓剂)或肠胃外施用(例如，肌肉内、静脉内或皮下)。优选的施用方式是口服，它可根据疾病程度调节。

本发明的化合物的实际施用量(即活性组分)依赖于许多因素，如待治疗疾病的严重性、治疗对象的年龄和相对健康程度、所使用的化合物的效能、施用途径和形式，以及其他因素。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规方法制备。例如使该化合物与一种或者多种载体混合，然后将其制成所需的剂型，如片剂、药丸、胶囊、半固体、粉末、缓释剂型、溶液、混悬液、配剂、气雾剂等等。

在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述盐类化合物的酪氨酸激酶抑制剂。

所述酪氨酸激酶包括c-met、vegf、kdr、ron、kit、pdgf、fgf、src激酶。

在本发明的另一方面，还提供了上述盐类化合物在制备治疗癌症的药物中的应用。

由于酪氨酸激酶是目前效果明显的抗肿瘤药物靶点，而本发明的盐类化合物具有显著的酪氨酸激酶抑制活性，通过实验证实这些化合物对各种癌细胞增殖具有抑制作用，因此本发明盐类化合物适用于治疗各种癌症。尤其是对于肺癌、胃癌、卵巢癌、结肠癌、恶性胶质瘤具有较好的治疗效果。

在本发明的另一方面，还提供了上述盐类化合物在制备治疗炎症的药物中的应用。

本发明盐类化合物与多种信号传导激酶如c-met、vegf、kdr、ron、kit、pdgf、fgf、src等都具有良好的生物活性作用，并与多种信号传导路径相关联，因此对多种疾病有治疗效果，如癌症、炎症、淋巴水肿、糖尿病等。

本发明的酪氨酸激酶抑制剂，能够抑制c-met、vegf、kdr等多种信号传导激酶的生物活性，能有效抑制细胞增殖，对多种疾病如癌症具有良好的治疗效果，尤其是对肺癌、胃癌、卵巢癌、恶性胶质瘤等具有显著的治疗效果，应用前景非常广阔。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例7的化合物6对人肺腺癌细胞hcc78的增殖抑制拟合曲线图；

图2是本发明实施例7的化合物6对人恶性胶质瘤细胞u87mg的增殖抑制拟合曲线图；

图3是本发明实施例7的化合物6对人脐静脉内皮细胞huvec的增殖抑制拟合曲线图；

图4是本发明实施例7的化合物2和4对人恶性胶质瘤细胞u87mg的增殖抑制拟合曲线图；

图5是本发明实施例7的化合物2和4对人胃癌细胞mkn-45的增殖抑制拟合曲线图；

图6是本发明实施例7的化合物2和4对人肺腺癌细胞hcc78的增殖抑制拟合曲线图；

图7是本发明实施例7的化合物2、4、6对人卵巢癌细胞sk-ov-3的增殖抑制拟合曲线图；

图8是本发明实施例7的化合物2、4、6对人结肠癌细胞hct116的增殖抑制拟合曲线图；

图9是本发明实施例7的化合物2、4、6对人肺腺癌细胞a549的增殖抑制拟合曲线。

具体实施方式

实施例1酪氨酸激酶抑制剂对甲苯磺酸盐化合物的合成

化合物1(n-[3-氟-4-[[6-甲氧基-7-[[3-(吗啉-4-基)丙基]氧]喹啉-4-基]氧]苯基]-n'-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺)(632mg,1mmol)溶于四氢呋喃(10ml)中，冰水浴至内温0℃后，加入对甲苯磺酸(173mg，1mmol)，室温下反应2h，反应完毕后过滤得白色固体n-[3-氟-4-[[6-甲氧基-7-[[3-(吗啉-4-基)丙基]氧]喹啉-4-基]氧]苯基]-n'-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺对甲苯磺酸盐(化合物2)650mg，产率81％。

¹hnmr(500mhz,dmso-d6):δ10.41(s,1h),9.99(s,1h),9.48(brs,1h),8.50(d,j＝5hz,1h),7.92(dd,1h),7.52-7.65(m,4h),7.40-7.48(m,4h),7.10-7.18(m,4h),6.46(d,j＝5.5hz,1h),4.26(t,2h),4.10(d,2h),4.10(m,1h),3.97(s,3h),3.66(t,2h),3.60(m,2h),3.15(m,2h),2.21-2.36(m,5h),1.45-1.51(m,4h)。

lc-ms(esi)m/z633(m+h)。

实施例2酪氨酸激酶抑制剂谷氨酸盐化合物的合成

化合物1(n-[3-氟-4-[[6-甲氧基-7-[[3-(吗啉-4-基)丙基]氧]喹啉-4-基]氧]苯基]-n'-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺)(632mg,1mmol)溶于四氢呋喃/水(10ml,1:1)中，冰水浴至内温0℃后，加入l-谷氨酸(147mg，1mmol)，室温下反应8h，反应完毕后过滤得白色固体n-[3-氟-4-[[6-甲氧基-7-[[3-(吗啉-4-基)丙基]氧]喹啉-4-基]氧]苯基]-n'-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺谷氨酸盐(化合物3)450mg，产率58％。

lc-ms(esi)m/z633(m+h)。

实施例3酪氨酸激酶抑制剂正丁磷酸盐化合物的合成

化合物1(n-[3-氟-4-[[6-甲氧基-7-[[3-(吗啉-4-基)丙基]氧]喹啉-4-基]氧]苯基]-n'-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺)(632mg,1mmol)溶于二氯甲烷(10ml)中，冰水浴至内温0℃后，加入正丁磷酸(154mg，1mmol)，室温下反应4h，反应完毕后过滤得白色固体n-[3-氟-4-[[6-甲氧基-7-[[3-(吗啉-4-基)丙基]氧]喹啉-4-基]氧]苯基]-n'-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺正丁磷酸盐(化合物4)650mg，产率83％。

¹hnmr(500mhz,dmso-d6):δ10.43(s,1h),9.94(s,1h),9.20(brs,1h),8.51(d,j＝5hz,1h),7.92(dd,1h),7.52-7.65(m,4h),7.40-7.48(m,4h),7.10-7.18(m,4h),6.46(d,j＝5.5hz,1h),4.21(t,2h),4.15(d,2h),4.08(m,1h),3.77(m,2h),3.66(t,2h),3.60(m,2h),3.15(m,2h),2.21-2.36(m,5h),1.45-1.51(m,4h),1.23(m,4h).1.10(t,3h),

lc-ms(esi)m/z633(m+h)。

实施例4酪氨酸激酶抑制剂苹果酸盐化合物的合成

化合物1(n-[3-氟-4-[[6-甲氧基-7-[[3-(吗啉-4-基)丙基]氧]喹啉-4-基]氧]苯基]-n'-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺)(632mg,1mmol)溶于四氢呋喃(10ml)中，冰水浴至内温0℃后，加入苹果酸(134mg，1mmol)，室温下反应8h，反应完毕后过滤得白色固体n-[3-氟-4-[[6-甲氧基-7-[[3-(吗啉-4-基)丙基]氧]喹啉-4-基]氧]苯基]-n'-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺苹果酸盐(化合物5)550mg，产率72％。

lc-ms(esi)m/z633(m+h)。

实施例5酪氨酸激酶抑制剂阿仑膦酸盐化合物的合成

化合物1(n-[3-氟-4-[[6-甲氧基-7-[[3-(吗啉-4-基)丙基]氧]喹啉-4-基]氧]苯基]-n'-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺)(632mg,1mmol)溶于n,n-二甲基甲酰胺(10ml)中，冰水浴至内温0℃后，加入阿仑膦酸(249mg，1mmol)，室温下反应8h，反应完毕后过滤得白色固体n-[3-氟-4-[[6-甲氧基-7-[[3-(吗啉-4-基)丙基]氧]喹啉-4-基]氧]苯基]-n'-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺阿仑膦酸盐(化合物6)150mg，产率17％。

lc-ms(esi)m/z633(m+h)。

实施例6酪氨酸激酶抑制活性检测

将上述实施例的盐类化合物应用于对c–met和kdr激酶抑制活性的检测和筛选。

1.方法

(1)向384孔板中加入4μl配制的激酶缓冲溶液，或是4μl的激酶溶液(100％抑制对照)；向孔中加入2μl的化合物，或是2μl不含化合物的buffer(0％inhibition对照)；以上所有样品或对照均设2复孔。

(2)25℃孵育5min；

(3)向孔中加入2μl的atp/底物/mgcl2/mncl2/seb/dtt混合液；

(4)1000rpm离心1min，30℃震荡孵育30min；

(5)向孔中加入8μlxl-665/抗体的混合液；

(6)25℃孵育1h；

(7)pherastarfs仪器读取665nm和620nm信号；

(8)根据试剂盒说明书分析数据，并用graphpadprism5拟合计算ic50。

ratio＝665nm/620nm

2.实验结果

各送检化合物及参比化合物的检测结果总结如下表1和表2所示，其中对照化合物是现有的c–met激酶抑制剂foretinib(结构式如下)。for-oxide、for-methyl的化学结构式也分别如下。

表1化合物6对c–met的抑制活性

表2化合物6对kdr的抑制活性

表3化合物2和4对c–met/kdr的抑制活性

由表1-3的数据可知，本发明上述实施例的盐类化合物具有c–met、kdr等酪氨酸激酶的抑制活性。

实施例7对肿瘤细胞增殖抑制试验

1.方法

(1)细胞培养：将肿瘤细胞(如人肺腺癌细胞hcc78、人恶性胶质瘤细胞u87mg、人胃癌细胞mkn-45、人脐静脉内皮细胞huvec、人肺腺癌细胞a549等)用细胞培养基培养，培养条件为37℃，5％co2。

(2)细胞接种：取处于指数生长期，状态良好的细胞，加入适量胰酶消化细胞，收集细胞离心，弃上清。用含血清的培养液重新混悬细胞，然后计数并取细胞悬液按3000/孔接种于96孔板上，90μl/孔。将培养板转入恒温co2培养箱中，在37℃，5％co2及饱和湿度条件下培养24小时。

(3)加入受试化合物：10μl/孔，培养72小时，每组设3个平行孔。

(4)结果测定：化合物作用72小时后，加入10μl/孔的cck8，置于培养箱中孵育适当时间，在450nm处测吸光值。

2.实验结果

各送检化合物的检测结果总结如下表4-6所示：

表4化合物6对人肺腺癌细胞hcc78、人恶性胶质瘤细胞u87mg、人脐静脉内皮细胞huvec、人胃癌细胞mkn-45的增殖抑制结果(对应的拟合曲线见图1-3)

表5化合物2和4对人恶性胶质瘤细胞u87mg、人胃癌细胞mkn-45、人肺腺癌细胞hcc78的增殖抑制结果(对应的拟合曲线见图4-6)

表6化合物2、4、6对人卵巢癌细胞sk-ov-3、人结肠癌细胞hct116、人肺腺癌细胞a549的增殖抑制结果(对应的拟合曲线见图7-9)

由上述表4-6的数据可知，本发明的盐类化合物通过抑制c–met、kdr等酪氨酸激酶的活性，能够有效抑制人肺腺癌细胞、人胃癌细胞、人结肠癌细胞、人卵巢癌细胞、人恶性胶质瘤细胞等各种癌细胞的增殖，特别适用于癌症的治疗。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。