本发明属于分子生物学领域，涉及一种抽提低拷贝质粒的方法。
背景技术：
现在的质粒抽提一般是利用碱裂解法，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异达到分离目的，高pH使质粒DNA和染色体DNA变性，同时沉淀蛋白质，再将pH值调至中性，质粒DNA较小，很容易复性成双链，而染色体DNA较大，缠结成网状不溶物质，从而可以通过离心除去。质粒拷贝数较低的情况下，用常规的碱裂解法抽提质粒，产量较低，不适合大量抽提，有氯霉素可以增加抽提产量的文献，但规模普遍较小，不适用大量质粒抽提。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种大量抽提低拷贝质粒的方法。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种抽提低拷贝质粒的方法，其特征在于挑取单菌落接种于3‐6ml含有相应抗生素的丰富培养基试管内，于37℃、220rpm，培养14‐17h至生长对数期，将培养的菌液扩大至300ml含有相应抗生素的丰富培养基，37℃、220rpm，培养2.5‐3h至OD600为1.5‐1.7，加入终浓度为150～200μg/ml的氯霉素，于37℃、220rpm诱导培养约14‐20h，然后常规抽提方法进行抽提。所述的常规抽提方法优选碱裂解法。
有益效果：
本发明通过氯霉素诱导，大大提高了低拷贝质粒的抽提量，成功降低基因组污染发生概率，提升产品一次通过率。
具体实施方式
实施例1
以抽提300μg pET系列的质粒为例：
1挑斑摇菌：
17：30在已转化好的LB平板上挑取长势较好的单菌落(圆形，饱满，非实心斑)于4ml含有相应抗生素的丰富培养基(配方：丰富1L氯化钠0.5g磷酸二氢钾3g硫酸铵5g十二水和磷酸氢二钠15g大豆蛋白胨10g酵母粉20g)，于37℃、220rpm，过夜培养至次日8：30(OD600≈4)。
2扩大培养
将过夜培养的4ml菌液扩大至300ml含有相应抗生素的丰富培养基，37℃、220rpm，培养约3h，至OD600≈1.5-1.7。
3诱导
加入终浓度为170μg/ml的氯霉素，于37℃、220rpm诱导培养约14-20h。
4抽提
1)500mL离心杯收菌；
2)加10ml溶液P1悬浮菌体，涡旋震荡30s，加200μl RNase(10mg/ml)于悬浮的菌体；
3)加10ml溶液P2裂解菌体，上下颠倒混匀，操作一定要轻柔；
4)加10ml溶液S3上下颠倒混匀，静置10min；
5)7500rpm离心15min；
6)将上清用滤纸过滤到玻璃瓶；
7)加1/3V上清(10ml)异丙醇于玻璃瓶，充分混匀；
8)将过滤后的上清加入吸附柱SD5004，7500rpm，1min；
9)7.2ml Wash Buffer洗柱两次；
10)弃废液，将吸附柱重新放回收集管中，空转2min；
11)将吸附柱放在一个新的50ml离心管中，在超净工作台中挥发酒精10min；
12)将1mL TE(EF)Buffer(65℃预热)加在吸附柱的中央，静置1min；
13)7500rpm离心2min至50mL灭菌离心管；
14)将质粒DNA转移至2mL灭菌离心管；
15)重复步骤4.12-4.14一次；
16)去除内毒素。
说明：
采用氯霉素诱导，最终得到了300ug质粒
直接采用正常方法进行抽提，最终只得到了100ug质粒
正常方法抽提步骤：
以抽提300μg pET系列的质粒为例：
1挑斑摇菌：
16：30在已转化好的LB平板上挑取长势较好的单菌落(圆形，饱满，非实心斑)扩大至300ml含有相应抗生素的丰富培养基，37℃、220rpm，培养约14h。
2抽提
1)500mL离心杯收菌；
2)加10ml溶液P1悬浮菌体，涡旋震荡30s，加200μl RNase(10mg/ml)于悬浮的菌体；
3)加10ml溶液P2裂解菌体，上下颠倒混匀，操作一定要轻柔；
4)加10ml溶液S3上下颠倒混匀，静置10min；
5)7500rpm离心15min；
6)将上清用滤纸过滤到玻璃瓶；
7)加1/3V上清(10ml)异丙醇于玻璃瓶，充分混匀；
8)将过滤后的上清加入吸附柱SD5004，7500rpm，1min；
9)7.2ml Wash Buffer洗柱两次；
10)弃废液，将吸附柱重新放回收集管中，空转2min；
11)将吸附柱放在一个新的50ml离心管中，在超净工作台中挥发酒精10min；
12)将1mL TE(EF)Buffer(65℃预热)加在吸附柱的中央，静置1min；
13)7500rpm离心2min至50mL灭菌离心管；
14)将质粒DNA转移至2mL灭菌离心管；
15)重复步骤2.12-2.14一次；
16)去除内毒素。
运用本发明方法进行抽提，对于pET的质粒来说，基因组污染的比例降低了约90％。