本发明涉及水产食品加工技术领域，具体地涉及一种具有ACE抑制和抗氧化功能的甲鱼蛋白肽及其制备方法。
背景技术：
高血压是对人类健康危害极大的一种疾病，潜伏期长。高血压的早期阶段，一般没有明显不适症，直至发生临床迹象心脏病发作、脑血管破裂而导致死亡。
血管紧张素转化酶(Angiotensin I converting enzyme，ACE)为肾素-血管紧张素系统的关键酶。血管紧张素原在肾素的作用下转化为血管紧张素I，血管紧张素I在ACE的作用下转化为血管紧张素II，刺激血管收缩，造成血压上升。抑制ACE的活性对降低血压有着积极的作用，因而开发有效的ACE抑制剂引起人们的极大关注。虽然来源于食物的ACE抑制肽比人工合成的ACE抑制剂作用弱，但是它有其独特的优点，不会产生降压过度的问题，安全性高，无副作用，除降压功能外，往往同时具有免疫促进、易消化吸收等功能。由于药物疗法存在副作用，天然食物中的降血压功能因子的开发利用将成为今后高血压非药物治疗的重要部分。
现有技术中关于ACE抑制肽开发的报道，主要是通过酶解的方法从水产动物体或牛乳乳清蛋白源获得ACE抑制肽，酶解过程通常都需要通过添加酸或碱来调节体系的pH值，这无疑影响了获得的ACE抑制肽产品的功能特性，且增加了操作的繁琐程度；还有的ACE抑制肽的制备方法在酶解后还有脱苦脱味的步骤，以改善水产动物的腥味等不适口的味道，这些方法均不同程度地增加了操作步骤和生产成本，制约了产业化规模化ACE抑制肽的生产及蛋白肽的得率。另一方面，现有技术从水生生物中获得的具有ACE抑制功能的肽往往仅具有ACE抑制功能，未发现有其他的生物活性功能，即产品性能单一。
目前国内外专利中未见利用甲鱼肉资源制备血管紧张素转化酶抑制肽的专利文献报道。本发明针对目前甲鱼蛋白产品开发的现状，利用甲鱼肉为原料，通过对甲鱼肉的超声波等预处理，在不添加任何酸和碱条件下，利用多种蛋白酶复合酶解，通过膜分离和凝胶分离技术，开发了同时具有特定降压和抗氧化功能的甲鱼蛋白肽，建立一套简单高效的多功能的甲鱼蛋白肽的制备方法。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的是在于提供一种具有ACE抑制和抗氧化功能的甲鱼蛋白肽。
本发明的另一目的在于提供上述甲鱼蛋白肽的制备方法。
本发明的再一个目的在于提供上述甲鱼蛋白肽的应用。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种具有ACE抑制和抗氧化功能的甲鱼蛋白肽及其制备方法，包括以下步骤:
(1)超声处理去脂的甲鱼肉浆液；
(2)加入复合蛋白酶进行二步法酶解，酶解过程无需添加酸或碱调节pH值；
(3)对酶解液离心并取上清液通过二步超滤法处理；
(4)滤液过柱层析分离，收集洗脱峰，即得。
步骤(1)所述的甲鱼肉浆液通过以下方式获得：新鲜甲鱼放血宰杀，取甲鱼肉，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,鱼肉清洗后在95℃水中保温5-10分钟，然后在甲鱼肉中加入2.0～4.0倍的水，用打浆机将甲鱼肉打成浆，通过6000～8000g离心10～15min，去上层脂肪，得到去脂的甲鱼鱼肉浆液。
其中，步骤(1)超声处理方法为将去脂的甲鱼肉浆液温度调至55-65℃，25-30kH的超声频率处理15-25min。
本发明通过大量实验发现，甲鱼肉浆液温度调至55-65℃进行超声处理，效果最好，能够较好地改变甲鱼肉蛋白的组织结构，使下面酶解步骤缩短酶解时间和较少的用酶量，就能够获得优质的蛋白肽。
在上述方法的步骤(2)二步法酶解中，第一步酶解加入的复合蛋白酶为碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶，二者质量比为1-2:1，且加入的复合蛋白酶质量为甲鱼肉质量的0.1％-0.3％。
优选地，第一步酶解条件为55-65℃酶解1-2h。
在上述方法的步骤(2)二步法酶解中，第二步酶解加入的复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和风味蛋白酶，二者质量比为1:1-2，且加入的复合蛋白酶质量为甲鱼肉质量的0.1％-0.3％。
优选地，第二步酶解条件为50-60℃酶解1-2h。
第二步酶解结束之后于90-95℃下保温3-5min，冷却至室温。
上述方法中，步骤(3)的两步超滤法为先用孔径大于5000D的膜超滤，再用孔径为3000D的膜超滤，得到分子量小于3000D的蛋白肽。
在本发明的实施例中，两步超滤法为利用孔径为10000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于10000的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的膜将分子量小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来。
本发明甲鱼蛋白肽的制备方法步骤(4)，是取分子量为小于3000的蛋白肽液，再经过凝胶分离，收集洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到分子量为小于3000D的具有较好血管紧张素转化酶(ACE)抑制和抗氧化功能的甲鱼肉蛋白肽。
在本发明的实施例中，是取分子量为小于3000的蛋白肽液，经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，流速为1.8-2.8mL/min，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到分子量为小于3000具有较好血管紧张素转化酶(ACE)抑制和抗氧化功能的甲鱼肉蛋白肽。
上述制备方法制备得到的甲鱼蛋白肽属于本发明的保护范围。本发明通过实验发现，本发明上述方法制备得到的甲鱼蛋白肽具有优异的ACE抑制和抗氧化功能。
进而，本发明提供了该甲鱼蛋白肽在制备降血压或抗氧化药物中的应用。含有本发明方法制得的甲鱼蛋白肽的食品、保健品或药物也属于本发明的保护范围。
本发明的优点在于：
(1)本发明开发的甲鱼肉蛋白肽制备方法简单，整个加工过程中没有添加酸或碱进行pH的调整，产品保持较好的功能特性，较易实现产业化生产。
(2)开发的蛋白肽具有较好的血管紧张素转化酶(ACE)活性抑制的功能，其IC 50值为小于0.4mg/mL，1.2mg/mL样品浓度的ACE抑制率达到90％以上，同时具有较好的抗氧化功能。能广泛应用于特需食品和营养食品的制造。
(3)本发明利用特定频率超声波技术处理一定温度(55-65℃)的甲鱼肉蛋白浆，可以明显改善甲鱼肉蛋白的结构，缩短酶解时间，提高甲鱼肉蛋白肽的功能和产品的得率。
(4)本发明方法制备得到的甲鱼蛋白肽食用安全，本发明采用多种食品级复合蛋白酶(碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶)，经在温和条件下，经过适度酶解获得特定分子量的甲鱼肉蛋白肽，不加任何添加剂，为100％甲鱼肉蛋白肽，产品具有良好的风味，较高的得率。
(5)本发明开发甲鱼蛋白肽中分子量小于1000D的肽的比例为90％以上，易于机体消化和吸收。
具体实施方式
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。
实施例1具有ACE抑制和抗氧化功能的甲鱼肉蛋白肽的制备方法
(1)取甲鱼肉100克，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗，鱼肉清洗后在95℃水中保温10分钟，然后在甲鱼肉中加入2.0倍的水200克，用打浆机将甲鱼肉打成浆，通过6000g离心10min，去上层脂肪，得到去脂的甲鱼鱼肉浆液。
(2)将去脂甲鱼肉浆液的温度调整到55℃，于超声波发生器中经超声波频率为30kH处理15分钟，改变甲鱼肉蛋白的组织结构。
(3)按照甲鱼肉重量0.3％的重量百分比比例向经过超声波处理的甲鱼肉浆液体中加入复合蛋白酶进行分步酶解，第一步加复合蛋白酶一(碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶组成，它们之间的质量比为1：1)0.2％，在60℃条件下进行酶解2h；然后进行第二步利用复合蛋白酶二(木瓜蛋白酶和风味蛋白酶组成，它们之间的质量比为1：2)0.1％，在55℃条件下进行酶解反应1.5h；在95℃下保温3分钟，冷却至室温，在4000g条件下离心15min，收集上清液。
(4)将步骤(3)所得的上清液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为10000道尔顿的陶瓷膜超滤，先取将分子量小于10000的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的膜将分子量小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来。
(5)取分子量为小于3000的蛋白液，再经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，流速为2.0mL/min，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到分子量为小于3000D的甲鱼肉蛋白肽。
实施例2具有血管紧张素转化酶抑制和抗氧化功能的甲鱼肉蛋白肽的制备方法
(1)取甲鱼肉500克，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,鱼肉清洗后在90℃水中保温8分钟，然后在甲鱼肉中加入3.0倍的水，用打浆机将甲鱼肉打成浆，通过7000g离心10min，去上层脂肪，得到去脂的甲鱼鱼肉浆液。
(2)将去脂甲鱼肉浆液的温度调整到60℃，于超声波发生器中经超声波(频率为25kH)处理25分钟，改变甲鱼肉蛋白的组织结构。
(3)按照甲鱼肉重量0.2％的重量百分比比例向经过超声波处理的甲鱼肉浆液体中加入复合蛋白酶进行分步酶解，第一步添加蛋白酶一(碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶组成，它们之间的质量比为1：1)0.1％，在65℃条件下进行酶解反应2h；然后进行第二步添加复合蛋白酶二(木瓜蛋白酶和风味蛋白酶组成，它们之间的质量比为1：1)0.1％，在60℃条件下进行酶解反应2h；在90℃下保温3～5分钟，冷却至室温，在3500g条件下离心15min，收集上清液。
(4)将步骤(3)所得的上清液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为10000道尔顿的陶瓷膜超滤，先取将分子量小于10000的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的膜将分子量小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来。
(5)取分子量为小于3000的蛋白液，再经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，流速为2.0mL/min，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到分子量为小于3000D的甲鱼肉蛋白肽。
实施例3具有血管紧张素转化酶抑制和抗氧化功能的甲鱼肉蛋白肽的制备方法
(1)取甲鱼肉1000克，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,鱼肉清洗后在95℃水中保温10分钟，然后在甲鱼肉中加入2.5倍的水2500克，用打浆机将甲鱼肉打成浆，通过7000g离心12min，去上层脂肪，得到去脂的甲鱼鱼肉浆液。
(2)将去脂甲鱼肉浆液的温度调整到65℃，于超声波发生器中经超声波频率为30kH处理15分钟，改变甲鱼肉蛋白的组织结构。
(3)按照甲鱼肉重量0.4％的重量百分比比例向经过超声波处理的甲鱼肉浆液体中加入复合蛋白酶进行分步酶解，第一步加复合蛋白酶一(碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶组成，它们之间的质量比为2：1)0.2％，在60℃条件下进行酶解1.5h；然后第二步加入甲鱼肉重量0.2％复合蛋白酶二(木瓜蛋白酶和风味蛋白酶组成，它们之间的质量比为1：1)，在55℃条件下进行酶解反应1.5h；在92℃下保温3分钟，冷却至室温，在4000g条件下离心13min，收集上清液。
(4)将步骤(3)所得的上清液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为10000道尔顿的陶瓷膜超滤，先取将分子量小于10000的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的膜将分子量小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来。
(5)取分子量为小于3000的蛋白液，再经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，流速为2.5mL/min，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到分子量为小于3000D的甲鱼肉蛋白肽。
实施例4甲鱼肉蛋白肽血管紧张素转化酶(ACE)抑制能力的测定试验
试验样品：实施例1、实施例2、实施例3制备的甲鱼肉蛋白肽ACE抑制能力按照如下方法进行：
ACE抑制率的方法。用高效液相色谱可以在228nm下定量检测释放出的Hip量，从而计算出多肽的ACE抑制率。
1)试剂的配置
pH8.3的磷酸盐缓冲溶液：用超纯水配制，其中含磷酸盐50mmol/L，NaCl 300mmol/L，调整pH到8.3；
ACE酶液：将2mL的磷酸盐缓冲液加入1U的ACE中，使其浓度变为0.5U/mL。
HHL溶液：使用磷酸缓冲液溶解HHL，使其终浓度为5mmol/L。
样品溶液：称取适量样品，用磷酸盐缓冲液所需浓度的溶液。
2)ACE抑制率测定的色谱条件
检测波长：228nm；流速:1mL/min；流动相A:超纯水(含0.1％三氟乙酸)，流动相B:甲醇(含0.1％三氟乙酸)；进样量:10μL，手动进样；
3)测定ACE抑制活性的方法
取120μL HHL底物溶液，加入20μL的样品混合均匀，在37℃恒温水浴中保温10min。然后加入10μL ACE酶液在37℃恒温水浴中反应30min，再加入150μL 1mol/L的HCl终止反应，得到反应液。该反应液利用HPLC进行分析，同时设置空白对照组。ACE抑制活性计算公式如下：
ACE抑制活性％＝(M-N)/M×100,
式中，M为对照组中马尿酸的峰面积，N为添加的样品组中马尿酸的峰面积。
4)半抑制浓度的测定
按照ACE抑制肽体外检测方法测定其抑制活性，以浓度为横坐标，ACE抑制率为纵坐标绘成圆滑的曲线，从曲线中计算出IC50值。结果见表1。
实施例5本发明甲鱼肉蛋白抗氧化活性的测定试验
试验样品：实施例1、实施例2、实施例3制备的甲鱼肉蛋白抗氧化活性肽。
按照如下方法进行：
(1)清除DPPH自由基能力：取1mg/mL的抗氧化活性肽1.5mL，加入99.5％乙醇1.5mL和0.02％DPPH乙醇溶液0.675mL混合，振荡混匀，室温下避光水浴30min，然后在517nm下检测体系吸光值。吸光值越低，体系的清除DPPH自由基能力越强。空白对照即是将样品溶液1.5mL换成去离子水1.5mL。
DPPH自由基清除能力％＝((空白吸光值-样品吸光值)/空白吸光值)×100。结果见表1。
(2)还原力测定：取1mg/mL的抗氧化活性肽1mL，加入0.2M磷酸缓冲液(pH 6.6)2.5mL和1％(质量分数)的铁氰化钾溶液2.5mL，混匀，然后在50℃水浴加热20min。取出迅速冷却，加入10％(质量分数)三氯乙酸(TCA)溶液2.5mL，混合均匀，然后在3000g下离心10min。取上清液2.5mL，加入去离子水2.5mL和1％(质量分数)三氯化铁溶液0.5mL，充分混匀，在室温下反应10min，用700nm波长测定吸光度。还原力即可用700nm波长处吸光值表示。结果见表1。
(3)氧化自由基吸收能力(ORAC)：不同浓度的抗氧化活性肽溶液20μL与75mM磷酸盐缓冲液80μL(pH 7.4)及200nM的荧光试剂50μL充分混合，然后在37℃温育15min，再加入80mM的AAPH溶液50μL。用酶标仪每分钟读取荧光值共进行100min。荧光的激发波长和发射波长分别是485nm和538nm。用磷酸缓冲溶液代替样品作为空白。以Trolox作为标准对照，使用的浓度为0，2，4，8，12，16μM，绘制荧光淬灭曲线，并计算荧光淬灭曲线下的积分面积(AUC)。AUC的计算公式如下：
其中：f0是0min时荧光值，fi是第i min时的荧光值。
ORAC值用样品曲线的斜率与Trolox曲线的斜率之比，ORAC值得单位表示为μM Trolox/mg肽。
表1本发明三个实施例制得的甲鱼蛋白肽的分子量及血管紧张素转化酶(ACE)抑制和抗氧化活性试验结果
结果(见表1)本发明甲鱼蛋白肽具有很好的血管紧张素转化酶(ACE)抑制能力ACE抑制活性(IC50值)低于0.35mg/mL，显著低于同类复合蛋白肽的IC50值，1.2mg/mL样品ACE抑制率达到90％以上，具有很好的血管紧张素转化酶(ACE)抑制能力。同时发明甲鱼蛋白肽具有具有较好的抗氧化能力，在1mgg/mL的条件下，其清除DPPH自由基能力达到89％以上，还原力达到0.87以上，其ORAC为16以上，也是一种较好的抗氧化肽。
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。