一种岩白菜素的D晶型固体物质及其制备方法与用途与流程

本发明属于医药化工技术领域，具体涉及了稳定的D晶型岩白菜素，并公开了制备该D晶型岩白菜素的方法。

背景技术：

岩白菜素，英文名为Bergenin，结构式如式1所示。岩白菜素又称为岩白菜素内酯、虎耳草素、矮茶素等。为一类二氢异香豆素类化合物，其化学名为3,4,8,10-四-O-羟基-2-羟甲基-9-O-甲基-2,3,4a,10b-四氢吡喃基[3,2-c]苯并吡喃-6-酮，化学式为C14H16O9，分子量为328.27。岩白菜素为白色疏松的结晶性粉末或针状结晶；味苦，无臭；遇热或光逐渐变色，在甲醇中溶解，在水或乙醇中微溶。因其具有较好的镇咳和抗溃疡作用被1990版《中华人民共和国药典》收为镇咳祛痰药。目前国内外对岩白菜素的结构修饰及活性进行了大量研究。发现其具有抗肿瘤、抗氧化、保肝、抑菌、抗病毒、抗HIV等活性。

晶型(crystalline forms, polymorphs)是指结晶物质晶格内分子的排列形式。同一药物由于药物晶型的不同，其物理、化学（溶解度、熔点、溶出度、生物有效性等方面）性质可能会有显著不同，直接影响药物的质量与药效，因此药物晶型研究也是新药研究中的重要内容之一。发明人想通过研究找到化学性质稳定，易于制备不同剂型或具有更高活性的岩白菜素新晶型。

中国专利CN101899052A公开了岩白菜素的化合物的B晶型及这种岩白菜素新晶型固体物质样品的制备方法，含有这种岩白菜素新晶型的药物组合物，发现了岩白菜素新晶型固体物质经口服固体给药后在生物体内的吸收与血药浓度特征；新晶型固体物质改变了原有晶型固体药物有效成分在生物体内的吸收速度、增强了生物体内血药浓度而达到提高药物在临床疾病治疗中优势防治作用。

中国专利CN101899053A公开了岩白菜素的化合物的晶C晶型及这种岩白菜素新晶型固体物质样品的制备方法，含有这种岩白菜素新晶型的药物组合物，发现了岩白菜素新晶型固体物质经口服固体给药后在生物体内的吸收与血药浓度特征；新晶型固体物质改变了原有晶型固体药物有效成分在生物体内的吸收速度、增强了生物体内血药浓度而达到提高药物在临床疾病治疗中优势防治作用。

技术实现要素：

本发明为了实现一种岩白菜素新的D晶型及其制备方法，提供了一种岩白菜素的D晶型固体物质及其制备方法与用途，其岩白菜素D晶型固体物质的抗肿瘤药理活性。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是:

一种岩白菜素的D晶型固体物质，当样品的化学纯度与晶型纯度均大于99.5%，使用粉末X射线衍射分析采用Cu-Kα 辐射实验条件时,其以2θ角度表示X射线粉末衍射在12.1±0.2°，14.6±0.2°，18.6±0.2°，19.9±0.2°，23.2±0.2°，25.3±0.2°，35.4±0.2°处有特征峰。

所述的当岩白菜素样品的化学纯度与晶型纯度均大于99.5%，使用粉末X射线衍射分析采用Cu-Kα辐射实验条件时，其以2θ角度表示X射线粉末衍射在12.1±0.2°，13.5±0.2°, 14.6±0.2°，17.1±0.2°, 18.6±0.2°，19.9±0.2°，20.1±0.2°, 22.5±0.2°, 23.2±0.2°，24.8±0.2°, 25.3±0.2°，27.9±0.2°, 35.4±0.2°，38.7±0.2°，40.1±0.2°，41.0±0.2°处有特征峰。

所述的岩白菜素的D晶型固体物质的红外光谱进行分析时在3424、3390、3250、2989、2959、2942、2891、2724、1704、1611、1529、1462、14/14、1378、1371、1341、1336、1306、1294、1231、1215、1205、1180、1134、1120、1104、1095、1072、1045、1028、1020、991、963、859、820、765、718、679、649、593、547 cm^-1 处有吸收峰存在，其中2942、2724、1704、1611、1462、1414、1341、1231、1180、1134、1095、1020、991、963、904、765、718、679、593、547 cm^-1峰为岩白菜晶型固体物质呈现D晶型特征的吸收峰位置。

所述的岩白菜素的D晶型固体物质的DSC图谱中主要有三个尖锐的特征吸收峰，并且均呈上升趋势，第一个峰表示晶型转变温度为150.84℃，第二个峰表示熔融温度即熔点为229.48℃，第三个峰表示气化温度为330.32℃。

一种D晶型岩白菜素的制备方法，向粉碎后的岩白菜素根中依次加入95%浓度的乙醇，分梯度和批次加热回流3-6次，每次1-4h，收集滤液，合并滤液，浓缩后静置1-4h，抽滤干燥得到岩白菜素粗品；向粗品里再次加入乙醇:乙腈=1:1的混合溶剂，加热回流，趁热抽滤，将滤液放入冰箱中冷却静置，然后在环境温度4℃~8℃、环境湿度10%~75%、常压或真空实验条件下结晶获得岩白菜的D晶型固体物质。

一种岩白菜素的D晶型固体物质应用于制备用于治疗肿瘤药物。

本发明中，在以2θ角度表示的X-射线粉末衍射特征峰中，“±0.2°”表示特征峰位置所允许的合理测量误差范围。

本发明的有益效果是：

本发明提供的岩白菜素的D晶型固体物质经MTT法测试，对非小细胞肺癌细胞(A549)、卵巢癌细胞（XB1309）有较好的抑制活性，可制备用于治疗肿瘤的药物。

说明书附图

图1岩白菜素D晶型样品的粉末X射线衍射图谱。

图2岩白菜素D晶型样品的红外吸收光谱图。

图3岩白菜素D晶型样品的DSC图谱。

图4岩白菜素D晶型样品的高效液相色谱图。

图5岩白菜素D晶型样品的核磁共振碳谱图、核磁共振氢谱图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进一步叙述，但本发明不局限与以下实施例，本发明实施例中所使用的试剂和采用的方法都为本领域的常规试剂和常规的操作方法。在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然尽可能详细描述。

一种岩白菜素的D晶型固体物质，当样品的化学纯度与晶型纯度均大于99.5%，使用粉末X射线衍射分析采用Cu-Kα 辐射实验条件时,其以2θ角度表示X射线粉末衍射在12.1±0.2°，14.6±0.2°，18.6±0.2°，19.9±0.2°，23.2±0.2°，25.3±0.2°，35.4±0.2°处有特征峰。

所述的当岩白菜素样品的化学纯度与晶型纯度均大于99.5%，使用粉末X射线衍射分析采用Cu-Kα辐射实验条件时，其以2θ角度表示X射线粉末衍射在12.1±0.2°，13.5±0.2°, 14.6±0.2°，17.1±0.2°, 18.6±0.2°，19.9±0.2°，20.1±0.2°, 22.5±0.2°, 23.2±0.2°，24.8±0.2°, 25.3±0.2°，27.9±0.2°, 35.4±0.2°，38.7±0.2°，40.1±0.2°，41.0±0.2°处有特征峰。

在一个具体实施例中，所述的岩白菜素晶型D，其特征在于，当样品的化学纯度与晶型纯度均大于99.5%，使用Cu-Kα辐射，其以2θ角度表示的X-射线粉末衍射具有如附图1所示的图谱。

更进一步地，所述岩白菜素的D晶型固体物质，其特征在于红外光谱进行分析时在3424、3390、3250、2989、2959、2942、2891、2724、1704、1611、1529、1462、14/14、1378、1371、1341、1336、1306、1294、1231、1215、1205、1180、1134、1120、1104、1095、1072、1045、1028、1020、991、963、859、820、765、718、679、649、593、547 cm-1 处有吸收峰存在，其中2942、2724、1704、1611、1462、1414、1341、1231、1180、1134、1095、1020、991、963、904、765、718、679、593、547 cm-1峰为岩白菜晶型固体物质呈现D晶型特征的吸收峰位置，具有如附图2所示的图谱。

所述的岩白菜素D晶型固体物质的差示扫描量热分析（DSC）检测结构显示在150-335℃范围内有吸收峰；更具体地，所述岩白菜素D晶型在DSC图谱中主要有三个尖锐的特征吸收峰，并且均呈上升趋势，第一个峰表示晶型转变温度为150.84℃，第二个峰表示熔融温度即熔点为229.48℃，第三个峰表示气化温度为330.32℃；在一个实施例中，具有如附图3所示的图谱：

一种岩白菜素D晶型固体物质的制备方法，该方法包括以下步骤：向粉碎后的岩白菜素根中依次加入95%浓度的乙醇，分梯度和批次加热回流3-6次，每次1-4h，收集滤液，合并滤液，浓缩后静置1-4h，抽滤干燥得到岩白菜素粗品；向粗品里再次加入乙醇:乙腈=1:1的混合溶剂，加热回流，趁热抽滤，将滤液放入冰箱中冷却静置，然后在环境温度4℃~8℃、环境湿度10%~75%、常压或真空实验条件下结晶获得岩白菜的D晶型固体物质。

本发明提供的岩白菜素D晶型固体物质具有较高的纯度和较好的收率，其纯度在99.7％以上，单个杂质含量在0.1％以下，其中一个实施例获得的高纯度D晶型岩白菜素纯率高达99.995%（见附图4），该方法工艺简单，操作方便，条件温和，不需要特殊的反应条件，因此适合规模化生产高纯度岩白菜素D晶型固体物质。

本发明所用的测试仪器：

1）X-射线粉末衍射仪

仪器型号：Thermo X’TRA 型X射线粉末衍射分析仪

测试方法：根据中国药典2010版二部（附录IX F X射线粉末衍射法）将研细后的样品(l00mg)填在玻璃板凹槽里，用载玻片将其平面与玻璃面挂齐平后，将样品置于Thermo X’TRA 型X射线粉末衍射分析仪中，使用40kV 40mA的铜X-射线源，扫描范围为2～45° (2θ)，扫描速度8° /分钟，扫描时间6分钟。扫描误差通常为土0.2°(2θ)。

2）差示扫描量热仪

仪器型号：METTLER TGA/DSCI。

测试方法：根据JY/T014-1996热分析方法通则，将重3.10mg的样品置于具有小针孔的密闭铝盘中，在50℃下保持平衡，然后以10℃/min的扫描速率加热至350℃。干燥氮气被用作吹扫气体。

实施例1

制备岩白菜素粗品

称取粉碎的岩白菜根100g加入1000mL圆底烧瓶中，向其中依次加入700mL、500mL、300mL 95%乙醇，加热回流三次，每次2h，用纱布过滤收集滤液，合并三次滤液。滤液减压浓缩至100~200mL, 将浓缩后的滤液倒入锥形瓶，放入冰箱中静置待其结晶，静置3d后，观察锥形瓶底部有大量颗粒型晶体析出，抽滤，干燥，得岩白菜素粗品4.3g。

实施例2

岩白菜素粗品D晶型样品的制备

将4.3g岩白菜素粗品加入250mL圆底烧瓶中，加入80mL 95%乙醇与80mL乙腈，加热回流15min，趁热抽滤（布氏漏斗已加热），除去大颗粒不溶性杂质。将滤液放入冰箱中静置待其结晶，静置4d后，观察有白色晶体析出，抽滤，然后用五氧化二磷作为干燥剂，在干燥器中干燥除水,得岩白菜素D晶型样品3.2g收率约82%，HLPC纯度99.995%, 如附图4所示；经测定，其X-射线粉末衍射图谱如图1所示；其DSC图谱如图2所示。

实施例3

核磁共振法鉴定岩白菜素结构

（结晶后的岩白菜素晶体10mg，可根据需要称取适量，加氘代DMSO试剂溶解，将配好的溶液置于核磁管中，测试岩白菜素13C谱、1H谱，对图谱进行解析并与标准图谱比对，所测岩白菜素13C谱、1H谱与标准图谱完全吻合，判断化合物是即为为岩白菜素。

实施例4

高效液相色谱法测定岩白菜素纯度

实施例2所制备的岩白菜素粗品D晶型样品经高效液相色谱法测试纯度为99.995%。色谱条件如下，色谱柱：C18柱；流动相为甲醇：水（32:68）；流量1.0mL/min；柱温为30℃；检测波长为275nm；对照品溶液制备：精密称取经五氧化二磷减压干燥12h的岩白菜素对照品11.90mg，加甲醇制成19.04μg/mL对照品溶液；供试品溶液制备：取样品细粉约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定质量，超声处理30min，放冷，再称定质量，用甲醇补充减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，既得；进样：样品及对照品的进样量均为5μL。

实施例5

岩白菜素粗品D晶型样品抗肿瘤活性测试

对本发明的化合物进行了肿瘤细胞增殖抑制试验，试验方法采用常规的MTT法。

细胞株选用：非小细胞肺癌细胞(A549)，人食管癌细胞(EC-9706)，人肝癌细胞(SMMC-7721)，卵巢癌细胞(XB1309)，人结肠癌细胞(HT-29)。培养液为DMEM+15%NBS+双抗。

样品液的配制：岩白菜素样品用DMSO(Merck)溶解后，加入PBS(-)配成的100 μmol/L的溶液或者均匀的混悬液，然后用DMSO的PBS(-)稀释，最终浓度分别为0.1，1，10，20，40，60，80, 100 μmol/L。

将上市的抗肿瘤药物阿糖胞苷(Ara-C)以同样的条件配成对照品溶液。

细胞培养：贴壁生长肿瘤细胞培养于含10% 灭活新生牛血清和青霉素、链霉素（各100万U/L）的1640培养液中，置于37℃，5% CO2，饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养。细胞贴壁生长，每2～3 天传代1 次，传代时首先倒出培养液，PBS洗2次，胰酶消化后，加入新鲜的培养液吹打均匀，调整细胞至适当浓度移入新的培养瓶中，添加培养液至适量。

取对数生长期细胞，消化、计数，以 2×104/mL 的密度接种于 96 孔培养板中，每孔100 μl。培养 24小时后，将待测化合物以0.1，1，10，20，40，60，80,100 μmol/L浓度处理细胞。实验组每个浓度设5个复孔，以含0.4% DMSO的培养液作对照。药物作用 48小时后，去上清，每孔加入100 μl MTT（2-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-3,5-二苯基-2H-四唑氢溴酸盐）(1mg/mL)，继续培养 4小时，弃上清，每孔加入100μl DMSO，振荡混匀，用酶标仪在570 nm处测定吸光度值，采用 IC50 计算软件求出半数抑制浓度(IC50)。

岩白菜素D晶型样品对不同肿瘤细胞的半数抑制浓度IC50（单位：μmol/L）

从表中可以看出，岩白菜素D晶型样品对非小细胞肺癌细胞(A549)，人食管癌细胞（EC-9706），人肝癌细胞(SMMC-7721)，卵巢癌细胞（XB1309），人结肠癌细胞（HT-29）均有一定的抑制活性，其中，D晶型样品化合物对非小细胞肺癌细胞(A549)、卵巢癌细胞（XB1309）有较好的抑制活性且接近Ara-C。

以上实验结果表明，本发明的岩白菜素D晶型具有良好的抗肿瘤活性，被认为是最有研究价值的。值得进一步的研究与开发。因此本发明可以用于制备抗肿瘤药物。