本发明涉及一种氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。
背景技术：
乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。
对GlcN的生物合成研究表明在大肠杆菌中，由谷氨酰胺作为氨基供体，6-磷酸果糖在氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)的催化作用下，生成GlcN，该步是GlcN合成途径中的第一个限速反应。而氨基葡萄糖-6磷酸合成酶是一种双底物结合酶，属于氨基转移酶类，催化活力较低。
技术实现要素：
本发明的目的首先是提供一种氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生GlmS的第38位的丙氨酸突变为谷氨酸，或者第249位的精氨酸突变为色氨酸，或者第471位的甘氨酸突变为丝氨酸。
本发明还提供获得所述氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体的方法，以pET28a-glmS-gna1为模版，通过定点突变将编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型GlmS的基因进行突变的，将携带编码突变体的基因的载体转入E.coli BL21(DE3)，培养重组菌得到氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体。
编码所述野生型GlmS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，来源于大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)。
本发明还提供提高乙酰氨基葡萄糖产量的方法，是以Escherichia coli BL21(DE3)为宿主，重组表达编码所述氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体的基因，得到重组菌；将重组大肠杆菌以种子培养基活化后以5～8％的接种量转入发酵培养基，于35～37℃、200～220rpm条件下培养，OD600达到0.6左右时加入0.4mM的IPTG诱导氨基葡萄糖-6磷酸合成酶的表达，使重组菌能以葡萄糖为底物生产乙酰氨基葡萄糖。
种子培养基(g/L)：胰蛋白脉10，酵母粉5，NaCl 10。
发酵培养基(g/L)：胰蛋白胨12，酵母粉24，磷酸氢二钾12.54，磷酸二氢钾2.31，甘油4，葡萄糖30。
本发明的有益效果：构建了3个有意义的突变体G471S、R249W、A38E，均实现了提高GlmS催化活力的作用，比野生型GlmS更有利乙酰氨基葡萄糖的合成。相比野生型GlmS酶，突变体G471S、R249W、A38T在发酵16h后，以葡萄糖为底物，G471S乙酰氨基葡萄糖产量36.975mg/L，与出发菌相比提高22.62％，R249W产量达到148.23mg/L，是出发菌种产量的4.66倍。A38E产量达到127.56mg/L，是出发菌株产量的4.01倍。
具体实施方式
乙酰氨基葡萄糖的测定方法：
高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1260，RID检测器，HPX-87H柱(Bio-Rad Hercules,CA)，流动相：5mM H2SO4，流速0.6mL/min，柱温35℃，进样体积10μL。
种子培养基(g/L)：胰蛋白脉10，酵母粉5，NaCl 10。
发酵培养基(g/L)：胰蛋白胨12，酵母粉24，磷酸氢二钾12.54，磷酸二氢钾2.31，甘油4，葡萄糖30。
实施例1突变位点的确定
GlmS的催化机制遵从有序反应机制，6-磷酸果糖先与谷氨酰胺结合，随着谷氨酰胺的水解，氨基转移且氨基糖的异构化，GlmS依次释放谷氨酸和GlcN-6-P。大肠杆菌的GlmS为同源二聚体，两个不同单体上的异构酶结构域在二聚体内侧，二聚体的外侧是两个谷氨酰胺结合的结构域。通过来源于E.coli的GlmS的PDB晶体结构分析(PDB编码为1JXA)确定G471、R249、A38为可能的提高酶活力位点。
实施例2突变体G471S、R249W、A38E的制备
(1)定点突变
利用快速PCR技术，以表达有野生型GlmS的基因的质粒pET28a-glmS-gna1(pET28a-glmS-gna1的构建方法参见CN103589696A)为模板，进行定点突变。
引入G471S突变的引物：
正向引物：5’-GCTGTTCCTGGCCGTGGCGATC-3’
反向引物：5’-GATCGCCACGGCCAGGAACAGC-3’
引入R249W突变的引物
正向引物：5’-CGGGCGATAAAGGCATTTACTGGCACTACATGCAGA-3’
反向引物：5’-TCTGCATGTAGTGCCAGTAAATGCCTTTATCGCCCG-3’
引入A38E突变的引物
正向引物：5’-CCGTTGTTGATGAAGAAGGTCATATGACCCGCC-3’
反向引物：5’-GGCGGGTCATATGACCTTCTTCATCAACAACGG-3’
PCR反应体系均为：5﹡PrimerStar Buffer 10μL，dNTPs(各2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，PrimerStar HS DNA Ploymerase(2.5U/μL)0.5μL，加入双蒸水32.5μL。
PCR反应扩增条件均为：98℃预变性4min；随后98℃10s，55℃15s，72℃8min进行30个循环，最后72℃保温10min。
将PCR产物经过Dpn I消化2h后，分别转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)的感受态细胞中，涂布到含有琼脂的LB固体培养基中培养过夜，挑取单菌落于LB液体培养基中培养过夜后提取质粒并进行测序验证。
(2)突变体的表达及产量测定
挑取测序正确的突变体与LB培养基中，在37℃，200rpm下培养过夜，以2％(v/v)接种量接种到TB培养基中，在37℃、200rpm培养到OD600为0.6，加入0.4mM IPTG诱导，诱导后发酵12h。
表达G471S、R249W、A38E的重组菌的发酵上清中，乙酰氨基葡萄糖产量分别是36.975mg/L、148.23mg/L、127.56mg/L，相比野生型提高22.6％、366.4％、301.7％。重组大肠杆菌种子培养及发酵培养基：
种子培养基(g/L)：胰蛋白脉10，酵母粉5，NaCl 10。
发酵培养基(g/L)：胰蛋白胨12，酵母粉24，磷酸氢二钾12.54，磷酸二氢钾2.31，甘油4，葡萄糖30。
实施例3发酵生产乙酰氨基葡萄糖
用LB斜面培养基培养重组大肠杆菌，培养12h后，用接种环取1环介入装有20mL种子培养基的250mL的三角瓶中培养，种子培养基中按照50μg/mL加入卡那霉素，在37℃、200rpm下培养12h。种子以5％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养，OD600等于0.6时加入0.4mM的IPTG诱导，诱导后培养16h。测定最终发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖的产量，结果表明表达G471S的重组菌的发酵上清中乙酰氨基葡萄糖产量36.975mg/L，与出发菌相比提高22.62％；表达R249W的重组菌的发酵上清中产量达到148.23mg/L，是出发菌种产量的4.66倍；表达A38E的重组菌的发酵上清中产量达到127.56mg/L，是出发菌株产量的4.01倍。通过提高GlmS催化活力，实现了提高乙酰氨基葡萄糖在重组大肠杆菌中的积累。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。