本发明涉及基因检测领域，具体而言，涉及用于人EGFR基因突变检测的探针、试剂盒及其检测方法。
背景技术：
：空气污染等环境因素导致近年来中国肺癌患病人数急剧增加。十万人肺癌发病率从2002年的39.6％增加到2011年的63％，尤其是儿童和青少年的发病率大幅提升。改革开放三十年以来，肺癌导致的死亡人数增加了465％，肺癌在我国已经成为发病率及死亡率均排名第一的恶性肿瘤。按传统的组织病理学分类，肺癌可分小细胞肺癌和非小细胞肺癌。非小细胞肺癌(Non-small-cellLungCancer，NSCLC)，包括鳞癌、腺癌、大细胞癌，与小细胞肺癌相比其癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚，非小细胞肺癌约占肺癌总数的80-85％。表皮生长因子受体(EpidermalGrowthFactorReceptor，EGFR)是表皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体。EGFR属于ErbB受体家族的一种，该家族包括EGFR(ErbB-1),HER2/c-neu(ErbB-2),Her3(ErbB-3)和Her4(ErbB-4)。EGFR属于酪氨酸激酶型受体，EGFR与其配体在胞外区结合后，EGFR分子间形成同二聚体，也可与其他HER家族分子结合形成异二聚体，之后其胞内区的酪氨酸激酶(TK)被激活，酪氨酸残基相互磷酸化，随后其下游偶联蛋白(PLCγ、aCBL、GRB2、SHC、p85)与该磷酸化部位特异性结合，将信号传递到下游的RAS-MAPK通路、PI3K-AKT通路、STAT通路等，从而激活增殖、细胞凋亡逃逸、血管新生、转移等与与肿瘤发生发展密切相关的生物学行为。在包括肺癌在内的各类肿瘤中，频繁发现EGFR基因的过度表达，而且还与预后有关，因此EGFR作为分子靶标倍受瞩目。研究表明，EGFR突变基因与酪氨酸激酶抑制类药物(tyrosinekinaseinhibitors，TKI)使用有疗效关联，这些药物包括Iressa(易瑞沙)和Tarceva(特罗凯)，EGFR基因突变影响着TKI的临床疗效。EGFR突变主要包括4种类型：外显子19缺失突变、外显子2l点突变、外显子18点突变和外显子20插入突变。目前发现EGFR基因突变90％以上的突变位于外显子19、21，最常见的EGFR突变为外显子19LREA缺失和外显子21L858R突变，二者均会导致酪氨酸激酶结构域活化，且均为TKI的敏感性突变，外显子20的T790M突变与EGFR-TKI获得性耐药有关，还有许多类型的突变临床意义尚不明确。肺腺癌患者EGFR基因敏感突变阳性率在高加索人群约为10％，在亚裔人群和我国均为50％左右。目前EGFR基因突变检测主要分为肿瘤组织样本的检测以及肿瘤循环DNA(CirculatingtumorDNA，ctDNA)的检测。目前，临床上主要通过组织活检或手术等方式获得的肿瘤组织样本来检测EGFR基因突变，但是由于获取肿瘤组织标本需采用侵入性手段，这个过程往往会增加病人的痛苦，产生额外的手术风险，并且肿瘤具有异质性，对于已经发生转移的癌症患者而言，通过穿刺或手术仅仅取某个部位的癌组织，并不能反映患者整体的情况。其次，有些患者自身的情况决定了其不适合组织活检，而有些肿瘤在受到穿刺或手术的扰动之后，有加速转移的风险。最后，组织活检存在费用高等待时间长等诸多问题，其滞后性对患者的治疗也是不利的。因此，近年来“液体活检”的概念正在兴起，其基本思想为运用血液等体液样本替代肿瘤组织样本行病理学、分子生物学的检测，通过检测患者体液样本(主要是血液)中的肿瘤循环DNA来获取肿瘤基因突变信息已经成为一种趋势。与目前标准的组织活检相比，革命性的液体活检具有下列不可替代的优势：创伤小、可重复性、均化异质性、实时判断疗效，并随肿瘤的发展而动态调整治疗决策。因此，2015年MITTechnologyReview发布的年度十大突破技术(BreakthroughTechnologies2015)，ASCO年度进展(Clinicalcanceradvance2015)中对未来十年的期许，液体活检均榜上有名。通过检测ctDNA以追踪整个病程中肿瘤的特异性基因改变，对肿瘤筛查、诊断、疗效监测及预后判断等具有重要价值，同时可从中探索肿瘤转移复发及耐药的分子机制，识别新的靶向治疗位点等，因此ctDNA的检测已经成为肿瘤液体活检应用的三大热门方向之一(注：另两个为CTC与外泌体)。目前，主要的基因突变检测方法主要包括直接测序法(PCR-sanger测序法)、扩增阻遏突变系统(Amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)、变性高效液相色谱法(Denaturinghigh-performanceliquidchromatograph，DHPLC)、高分辨率溶解曲线(highresolutionmelting，HRM)、等位基因特异的Taqman聚合酶链式反应(Competitiveallele-specificTaqmanpolymerasechainreaction，CAST-PCR)、数字PCR(digitalPCR,dPCR)、高通量测序技术(High-throughputsequencing，HTS)等。1、直接测序法。直接测序法首先针对突变位点设计PCR引物，通过PCR扩增获得目的基因片段，然后对PCR产物进行sanger测序并对测序结果进行初步分析。初步分析完成后，对可能携带突变信息的样本的PCR产物，需要通过切胶等方法回收，回收后的PCR产物连接克隆载体(一般为质粒)，挑选阳性克隆测序以确认突变。2、扩增阻遏突变系统。该方法利用PCR引物的3’端末位碱基必须与模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计针对突变位点的特异性PCR扩增引物，在严格的扩增条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时PCR反应才能正常进行，从而检测出突变。通过设计两条上游引物，其中一条的3’端与正常基因序列互补，另一条的3’端与突变基因序列互补，检测时分别加入两种上游引物及共用的下游引物，进行两个平行的PCR,根据两个PCR反应的结果，可以区分是否存在突变以及突变为纯合子还是杂合子。ARMS方法的检测灵敏度大约在1％左右。3、变性高效液相色谱法。该方法的原理基于发生错配的杂合双链DNA与完全匹配的纯合双链DNA解链特征的差异，利用色谱方法进行分离。由于杂合双链在突变位点处出现错配，易于形成“Y”型结构，与色谱柱的固定相结合能力降低，因此杂合双链DNA比纯合双链DNA优先洗脱出来，通过洗脱峰的改变可以判断是否存在突变。该方法的优点在于对已知及未知的突变均可以检测，但检测前仍需通过PCR获取目的基因片段，检测过程需要打开反应管，容易造成污染，检测灵敏度在5％左右，且对于阳性结果并不能确定其具体突变类型，最终还是需要测序验证。4、高分辨率溶解曲线。该方法是基于核酸片段的物理性质，通过饱和染料结合于PCR扩增产物，监测PCR产物的溶解曲线变化分析基因突变。该方法的检测灵敏度大约在5％左右，对于阳性结果并不能确定具体突变类型，最终还是需要测序验证。5、等位基因特异的Taqman聚合酶链式反应。该方法采用优化Taqman探针，通过特异性MGB探针阻止PCR引物与野生型DNA的结合，因此可以优先扩增突变型DNA，该检测方法的灵敏度在1％左右。6、数字PCR。数字PCR基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。主要采用微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。数字PCR的检测灵敏度大约在0.1％左右。7、高通量测序技术。该技术是对传统Sanger测序(称为一代测序技术)革命性的改变,其基本原理是边合成边测序，在Sanger等测序方法的基础上，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号(例如Illumina测序平台)，或者通过半导体测序芯片捕捉DNA合成过程中的H+变化(例如Lifeiontorrent测序平台)，并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息，一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定,又被称为下一代测序技术(nextgenerationsequencing，NGS)。该技术的最大优势在于其高通量，可以同时对多个样本进行并行测序，除已知突变外还能发现未知突变，检测灵敏度大约在1-5％左右。高通量测序的检测流程一般包括DNA提取与纯化、构建文库、测序模板制备、测序、生物信息分析环节。但是，现有技术存在以下缺陷：直接测序法。直接测序法具有能够确定突变范围和类型的优点，但由于sanger测序通量低，以及测序方法本身的限制导致其灵敏度不高，只能对含量大于20％的基因突变进行检测，远远不能满足实际应用的需要，尤其是对于异质性的肿瘤体细胞突变，低灵敏度将导致大量的漏检。同时，测序法检测操作复杂，时效性差，对于要求高时效性和高灵敏度实际应用检测，测序法的局限性早已凸显。扩增阻遏突变系统需要采用实时荧光定量PCR检测技术，每对引物只能检测一种突变，且每种突变需要单独建立一个PCR反应体系，同时检测多个样本多个检测位点时操作繁琐，且该方法需要抽提及纯化DNA，对样本的需要量较大，不适合同时检测多个基因突变位点，且PCR操作过程易产生气溶胶污染，带来假阳性风险。等位基因特异的Taqman聚合酶链式反应亦存在同样的缺点。变性高效液相色谱法及高分辨率溶解曲线法且对于阳性结果并不能确定其具体突变类型，最终还是需要测序验证。两种方法的检测灵敏度在5％左右，不能满足实际应用的需要。数字PCR技术虽然灵敏度较高，但该技术同样极易产生假阳性结果，同时由于其操作复杂，对实验操作的要求极高，此外设备及试剂价格昂贵严重限制了其大规模推广应用。高通量测序技术需要经过DNA提取与纯化、构建文库、测序模板制备、测序数个环节，操作繁琐，对实验操作的要求极高。同样，昂贵的设备及试剂价格严重限制了其大规模推广应用。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供用于人EGFR基因突变检测的探针，这些探针由捕获探针和检测探针组成，捕获探针特异性捕获人EGFR基因的突变位点，检测探针检测突变位点旁侧序列，进而实现精准检测的目的。本发明的第二目的在于提供人EGFR基因突变检测试剂盒，该试剂盒只需少量检测样本，检测过程利用电场作用，加快反应速率，缩短反应时间，整个检测过程可以在半小时内完成，大大节约检测所需时间，并且检测灵敏度和准确率高。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：本发明提供的用于人EGFR基因突变检测的探针，所述探针包括1-35探针对中的任一种或多种，每个探针对中包括捕获探针和检测探针；1-35探针对的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1-70所示。本发明提供的探针是依据如SEQIDNO：71-91所示的野生型序列和如SEQIDNO：92-126所示的突变型序列依次进行的设计，其中，1-35探针对依次对应于SEQIDNO：92-126所示的突变型序列，而突变型序列为SEQIDNO：92、93、94对应的野生型序列均为如SEQIDNO：71所示；突变型序列为SEQIDNO：96、97、99、100、101、103、116、117、118、121、122、123、125对应的野生型序列均为如SEQIDNO：73所示。其余的突变型序列按序号依次与野生型序列对应。申请人经过大量试验，兼顾捕获探针和检测探针的灵敏度和特异性，最终筛选得到灵敏度和特异性均很好的1-35探针对。1-35探针对依次对应于上述的突变型序列和野生型序列。本发明提供的用于人EGFR基因突变检测的探针中的1-3探针对是针对EGFR的外显子18点突变设计，4-28探针对是针对EGFR的外显子19缺失突变设计，29-33探针对是针对EGFR的外显子20突变设计，34-35探针对是针对EGFR的外显子21点突变设计。具体地，1-3探针对的核苷酸序列如SEQIDNO：1-6所示；1探针对中的捕获探针的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，检测探针如SEQIDNO：2所示；2探针对中的捕获探针的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，检测探针如SEQIDNO：4所示。相应地，其余探针对以此类推。本发明经多次筛选得到的捕获探针与检测探针配合作用，具有灵敏度高，特异性强，能检测含有目标序列的各类样本，结果准确可靠。具体地，本发明涉及的序列如表1所示。表1序列本发明采用电信号的变化实现对EGFR基因突变位点的检测，基于此，进一步地，所述检测探针上设置有标记物，所述标记物优选为地高辛、生物素、异硫氰酸荧光素标记物中的任一种。这样，检测探针与后续添加的带有对应标记的酶结合，为检测电信号变化提供基础。本发明还提供了人EGFR基因突变检测试剂盒，至少含有上述的探针、酶以及与所述酶对应的底物中的任一种或多种；所述酶上标记有与所述检测探针上设置的标记物结合的物质。优选地，当检测探针上的标记物为地高辛或异硫氰酸荧光素(缩写FITC)时，酶上标记的物质相应的为地高辛抗体或异硫氰酸荧光素抗体；当检测探针上的标记物为生物素时，酶上标记的物质为亲和素。即检测探针与酶可通过FITC与抗FITC抗体或地高辛与地高辛抗体或亲和素如链霉亲和素与生物素结合等的方式进行结合。优选地，所述酶为辣根过氧化物酶聚合物(缩写Poly-HRP)或碱性磷酸酶；当所述酶为辣根过氧化物酶聚合物时，底物为TMB与H2O2的混合物、邻苯二胺(O-phenylenediamine，OPD)、ABTS[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobinesulfonate-6)]、3-(4-羟基)中的任一种；其中，OPD氧化后的产物为深桔黄色或棕色，ABTS反应产物呈蓝绿色。当所述酶为碱性磷酸酶时，底物为对硝基苯磷酸盐(p-nitropheny—phosphatedisodiumsalt，pNPP)、BCIP和NBT的组合物、4-硝基苯磷酸二钠、萘酚AS-BI磷酸盐、萘酚-AS-MX-磷酸盐中的任一种。其中，pNPP在碱性磷酸酶的作用下生成黄色水溶性反应产物；BCIP和NBT是碱性磷酸酶最佳的发色底物组合之一，产物为深蓝色；4-硝基苯磷酸二钠，产物为黄色可溶性；萘酚AS-BI磷酸盐，产物为红色不溶性；萘酚-AS-MX-磷酸盐，产物为红色不溶性。本发明提供的EGFR基因突变检测试剂盒，为EGFR基因突变的检测提供便捷。为了更便于检测，优选地，所述试剂盒还包括用于将所述捕获探针固定的固定物、杂交buffer、封闭蛋白、PBS、清洗液、检测孔板。其中检测孔板的具体结构如申请号为201620769829.2公开的名称为检测电极以及检测孔板中的检测孔板所示。进一步地，所述封闭蛋白为酪蛋白、胎牛血清、小牛血清中的任一种。本发明提供的试剂盒中的各物质可以单独存在，也可以以混合液的形式存在。进一步地，所述固定物包括导电聚合物材料和盐离子化合物；所述导电聚合物材料为苯胺、噻吩和吡咯导电分子单体中的任一种；所述盐离子化合物为氯化盐、硝酸盐、硫酸盐中的任一种。其中，盐可以为钠、钾、镁、铵等等；如氯化盐可以为氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化铵等，同样地，硝酸盐可以为硝酸钠、硝酸钾、硝酸镁、硝酸铵等，硫酸盐可以为硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫酸铵等等。本发明提供的EGFR基因突变检测试剂盒用于检测时，第一步通过电场条件下发生聚合反应而将捕获探针固定于检测孔板上，为后续检测提供基础。因此，为了便于检测操作，优选地，所述捕获探针与所述固定物以捕获溶液的形式存在，所述捕获溶液含有以下成分：导电聚合物材料的体积百分数为0.1％～5％，盐离子化合物的浓度为0.01mol/L～2mol/L，捕获探针的浓度为0.5-1.5μmol/L。即在检测进行时，直接将捕获溶液添加到检测孔板的反应孔中即可，一般来说，96孔的检测孔板中，每个反应孔的体积为300μl左右，加入20-80μl捕获溶液都可。捕获溶液添加至检测孔板的反应孔中后，进行电场处理，使得捕获溶液中的成分固定于检测孔板的反应孔中，以利于后续反应的进行。为了提高检测的便捷性，进一步地，所述捕获探针与所述固定物附着于所述检测孔板存在；具体采用以下方法制备：将所述捕获溶液添加到所述检测孔板的反应孔中，然后于电场处理后清洗即可。清洗时，程序为：从底部清洗程序：边注液边吸液；从上往下清洗程序：先注液，再吸液；重复一次上述步骤。清洗后加入待测样本与杂交buffer的混合液，其中，杂交buffer于85-95℃水浴中处理5-15min，然后放置冷却至室温，与待检测样本以体积比为1:1.5-2.5混匀，然后取20-80μl加入检测孔板的反应孔中，进行电场处理，然后采用与上述相同的清洗步骤进行清洗。本发明中的杂交buffer为探针的杂交提供良好的环境，任何实现该功能的杂交buffer均在本发明的保护范围内。如所用的杂交buffer可以为以下中的任一种；杂交buffer1：含有Ficoll4001g/L，PVP3601g/L，BSA1g/L，NaH2PO480mM，Na2HPO4420mM，EDTA2.5mM，SDS6g/L，NaCl43.8g/L，二水柠檬酸钠36.9g/L，pH为7-8；该buffer在使用前先加热至65℃。杂交buffer2：该溶液中，20×SSC的体积百分数为10％，100×Denhardt的体积百分数为5％，DenaturedsalmonDNA的质量浓度为0.1mg/ml，甲酰胺的体积百分数为40％；杂交buffer3：50％甲酰胺，2×SSC，10％硫酸葡聚糖(pH为7)；杂交buffer4：1.5MNaCl，40mMpH7.2的磷酸钠缓冲液，10mMEDTApH8，10×Denhardt's溶液，0.2％SDS；杂交buffer5：20-100nMTris-HCl，20-200nMMgCl2，0.01％-5％硫酸葡聚糖；杂交buffer6：5×SSC，1％封闭蛋白，0.1％N-月桂酰肌氨酸，0.02％SDS；杂交buffer7：0.5M磷酸二氢钠，pH为7.5；10mMEDTA，7％SDS。上述杂交buffer中的百分数均指质量百分含量，各组分的含量也均为各组分在整个溶液中的终浓度。另外，本发明上述的杂交buffer中各组分的含量，可以有小幅度变动，这种变动也在本发明的保护范围内。进一步地，所述检测探针以检测溶液的形式存在；所述检测溶液是以PBS作为溶剂，其中封闭蛋白的重量百分数为0.1％～5％，检测探针的浓度为0.5-1.5μmol/L。检测溶液中封闭蛋白如酪蛋白的作用是封闭检测物中非特异性位点，以提高检测的灵敏性和准确度。进一步地，检测溶液20-80μl添加至检测孔板的反应孔中，电场处理，然后采用与上述相同的清洗步骤进行清洗。进一步地，所述酶是以酶液的形式存在；所述酶液是以PBS作为溶剂，其中封闭蛋白的重量百分数为0.1％～5％，酶的体积百分数为0.05％～0.2％。为了封闭检测物中非特异性位点，提高检测的灵敏性和准确度，酶液中也含有封闭蛋白。相应地，酶液的添加量为20-80μl，室温孵育20-40min，检测孔板进行清洗，清洗程序比上述清洗程序多一次重复。进一步地，所述清洗液包括含有质量浓度为0.04％-0.06％SDS的0.1×SSC-2×SSC混合液和含有体积百分数为0.05％-0.15％Tween20的PBS溶液。PBST(0.1％Tween20)1L:949ml的双蒸水中加入50ml的20×PBS，混匀，加入1ml的Tween20，混匀。本发明中采用两种清洗液，在加入酶液之前的步骤均是采用质量浓度为0.04％-0.06％SDS的0.1×SSC-2×SSC混合液进行清洗，而由于加入酶后用PBST洗。通过清洗，把非特异性的结合以及其他未反应的成分去除，提高检测的准确性。另外，本发明上述的混合液均是工作液的浓度，然而根据需求也可以按上述工作液的浓度的数倍先配成母液，在使用时再相应的稀释即可。因此，相应浓度的母液也在本发明的保护范围内。其中，20×PBS1L配方为：磷酸二氢钾：5.4g，磷酸氢二钠：28.4g，氯化钠：160g，氯化钾4g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。相应地，PBS即为1×PBS，将20×PBS稀释20倍即可。清洗液也一般是先配置高浓度的SSC和SDS，再进行相应的稀释即可。本发明提供的人EGFR基因突变检测试剂盒，与现有技术相比，兼具精准可靠、快速便捷、经济的明显优势，利于反复多次取样检测，使用范围广，取样对人体无损伤，是理想的液体活检产品。本发明还提供了一种检测人EGFR基因突变的方法，包括以下步骤：将上述的捕获溶液加入到检测孔板中，电场处理3-10个循环，电场处理的程序为：电压200-500mV，1-5s；电压800-1500mV，1-5s；电场处理完毕后采用所述质量浓度为0.04％-0.06％SDS的2×SSC混合液清洗，然后加入待测样本与杂交buffer的混合溶液，电场处理3-10个循环，电场处理的程序为：电压200-500mV，1-5s；电压300-800mV，1-5s；检测孔板清洗，然后加入上述的检测溶液，电场处理3-8个循环，电场处理的程序为：电压200-500mV，1-5s；电压300-800mV，1-5s；检测孔板清洗，然后加入上述的酶液，孵育后清洗；加入底物，在电压为-100～-300mV的电场处理下读数，得到电流值。优选地，所述待测样本为体液，所述体液包括但不限于血浆、唾液、胸腔积液。本发明提供的检测人EGFR基因突变的方法，捕获溶液加入检测孔板，在电场作用下发生聚合反应，将捕获探针固定在板底；然后加入检测样本，捕获探针捕获目标基因突变样本；加入检测溶液，生物素标记的检测探针检测突变位点旁侧序列；加入酶液，酶通过其标记的亲和素与检测探针的生物素识别并结合；加入酶的底物，发生氧化还原反应，产生电流，检测电流信号即完成整个检测过程。与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)操作简便快速现有技术都是基于PCR技术，首先需要从标本中提取及纯化DNA，然后需要对DNA样本进行PCR扩增，NGS更是要经过DNA提取与纯化、构建文库、测序模板制备、测序等环节，操作步骤繁杂，对操作的要求极高。因此，临床上如果采用ARMS-PCR、数字PCR技术需要1-3天才能出报告，采用NGS技术更是需要1-2周才能出报告，对于需要争分夺秒采取恰当治疗措施的肿瘤疾病来说，这样的报告周期严重制约其在临床的应用。本发明提供的试剂盒通过电场诱导释放和测量(EFIRM)检测外体生物标志物，用于液体活检时，只需少量患者体液样本，比如抽取1ml病人的外周静脉血或采集患者少量唾液，样本不需要DNA提取和扩增，只需将约50μl待测血浆或唾液样本与检测试剂加入检测孔板的相应反应孔当中，再将检测孔板放入申请号为201610658321.X公开的保持结构及包括保持结构的检测仪中的检测仪(即EFIRM仪)进行电场处理和电信号的检测即可。检测过程利用电场作用，加快反应速率，缩短反应时间，整个检测过程可以在半小时内完成，大大缩短了检测时间。(2)高灵敏度与准确率ARMS的灵敏度大约在1％左右，NGS如果采用PCR扩增子测序或捕获测序灵敏度大约在1-5％左右，灵敏度最高的为数字PCR，大约在0.1％左右。本发明采用EFIRM技术检测ctDNA的灵敏度可以达0.1％，与数字PCR相当，达到目前ctDNA检测技术的先进水平。在准确率方面，由于ctDNA具有严重碎片化(平均长度仅为166bp)、含量低(占外周血游离DNA的比例不到1％)、半衰期短(约2小时)等特性，因此对检测技术的要求极高，目前市场上商品化的ctDNA检测试剂中，基于ARMS-PCR技术的产品准确率一般在60-70％左右，与临床需求相去甚远，因而严重制约了其临床应用。本发明提供的人EGFR基因突变检测试剂盒在临床预试验中，与组织活检结果对照准确率超过95％，同期采用数字PCR技术的准确率只有70％左右，因此，准确率明显优于现有市场上的产品。(3)成本低廉首先，在检测设备方面，目前无论是ARMS-PCR还是数字PCR都采用荧光信号检测，检测设备需配备昂贵的荧光检测系统，因此ARMS-PCR技术使用的荧光定量PCR仪市场售价都在数十万元左右，而数字PCR仪更达100多万元。至于NGS技术所使用的高通量测序仪，无论是以illumina为代表的光学测序或以ionproton为代表的半导体测序系统，市场售价更高达数百万元，高昂的价格严重制约了其在临床的推广应用。与之相比，本发明采用电场引导的释放与测量技术，检测过程利用电场作用，反应快速，最终结果以电信号的形式检测，因此检测设备不像ARMS-PCR及数字PCR那样配备昂贵的荧光检测系统，因而设备的成本大幅降低，仅相当于荧光定量PCR仪的一半左右，更不及高通量测序仪的十分之一。其次，在检测试剂方面，EFIRM技术基于核酸杂交的原理，采用独特设计的电化学技术，检测用的探针无需像ARMS-PCR那样进行荧光标记，并且由于节省了DNA提取与纯化的步骤，因此检测试剂成本与之相比大幅降低。与NGS需要经过DNA提取与纯化、构建文库、测序模板制备、测序数个环节，使用多个配套试剂盒相比，EFIRM的试剂成本更是节约了90％以上，竞争优势明显。(4)大幅降低对临床客户硬件及人员的要求由于采用EFIRM不需要DNA提取和PCR扩增，因而不存PCR容易污染的问题，在临床使用时无需建立临床基因扩增实验室，操作人员亦不需要获得临床基因扩增的上岗许可，可以由一般技术人员操作，使得液体活检技术在临床推广应用的门槛大大降低，利于液体活检技术大范围的推广，摆脱现有ARMS-PCR、数字PCR、NGS技术只能在少数具备条件的大型三甲医院开展的现状。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例1对不同检测样本分别采用以下步骤进行检测：1、捕获探针固定在检测孔板的板底1.1pyrrole与捕获探针(简称CP)的混合液配制：取1个1.5ml离心管，依次加入超纯水885μl，100μl3MKCl，涡旋震荡混匀，离心；加入5μlpyrrole，涡旋震荡混匀，离心；加入100μM捕获探针10μl；涡旋震荡混匀后离心，备用。1.2加样：在96孔的检测孔板上，每个孔加入30μl的已配制好的混合液，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打检测孔板使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后立刻到EFIRM检测仪上进行电场操作。1.3EFIRM电场处理：在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：350mV，1s；电压B:950mV，1s；进行5个循环。电场处理完毕，立刻取出，清洗检测孔板。1.4检测孔板清洗：在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(2bottom，2top)，洗液选择2×SSC(0.05％SDS)。清洗完毕，立刻进行下一步样本上样操作。2、样本杂交：2.1杂交buffer预处理杂交buffer(使用
发明内容中的杂交buffer1)在水浴锅中90℃水浴处理10min，然后室温放置冷却20min。2.2样本的配制样本从-20℃冰箱取出，放进4℃冰箱解冻。完全溶解后，样本与杂交buffer按体积比1:2混合，涡旋振荡后离心，即可上样进行检测。2.3加样：在检测孔板上，在对应的孔里加入空白对照buffer、相应浓度的阴性对照(WT)和阳性对照(MT)，上样量30μl。加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打检测孔板使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后立刻到EFIRM上进行电场操作。2.4EFIRM电场处理：在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：300mV，1s；电压B:500mV，1s；进行5个循环。电场处理完毕，立刻取出，清洗检测孔板。2.5检测孔板清洗：在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(2bottom，2top)，洗液选择2×SSC(0.05％SDS)。清洗完毕，立刻进行DP加样操作。3、检测杂交3.1DP(检测探针)溶液配制：从4℃冰箱取出酪蛋白的重量百分数为2％的casein/PBS溶液，取1个1.5mL离心管，加入990μl的casein/PBS，加入100μM的DP10μl，涡旋震荡混匀，离心，备用。3.2加样：根据实验设计在对应的孔加入对应DP溶液30μl，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打检测孔板使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后立刻到EFIRM上进行电场操作。3.3EFIRM电场处理：在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：300mV，1s；电压B:500mV，1s；进行5个循环。电场处理完毕，立刻取出，清洗检测孔板。3.4检测孔板清洗：在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(2bottom，2top)，洗液选择2×SSC(0.05％SDS)。清洗完毕，立刻进行加样操作。4、ReporterHybridization4.1Poly-HRP溶液配制：从4℃冰箱取出酪蛋白的重量百分数为2％的casein/PBS溶液，取1个1.5mL离心管，加入999μl的casein/PBS(把casein/PBS溶液放回4℃冰箱)，加入1μl的poly-HRP(购自thermofisher，产品名称为PierceTMStreptavidinPoly-HRP，货号为21140，单位规格为0.5mL)，涡旋震荡混匀，离心，备用。4.2加样：根据实验设计在对应的孔加入Poly-HRP溶液30μl，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打检测孔板使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后盖上检测孔板盖子，实验台上室温孵育30min，计时器倒数计时。孵育时间到，立刻清洗检测孔板。4.3检测孔板清洗：在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(3bottom，3top)，洗液选择PBST(0.1％Tween20)。清洗完毕，立刻进行TMB加样操作。5、Readout5.1加样：根据实验设计在对应的孔加入TMB/H2O2溶液(购自thermofisher,产品货号为34022，名称为TurboTMB底物溶液)，每个孔加入60μl，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极。加完立刻到EFIRM上进行电场操作。5.2EFIRM电场读数：在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：-200mV，60s，得到电流读数。本实施例中，不同检测样本包括阴性组和阳性组，阴性组测定的基因为相应的野生型序列，阳性组测定的基因为相应的突变型序列，每个样本设置20个平行孔进行检测。相应地，每组的阴性组(WT)和阳性组(MT)采用相应的探针对进行检测，以鉴定其检测的稳定性，检测的电流的变异系数(CV)结果如表2所示。表2中，变异系数cv(coefficientofvariation)，亦称离散系数(coefficientofdispersion)或相对偏差(rsd)，是标准偏差与平均值之比，用百分数表示，计算公式为：cv＝sd/mean×100％。表2检测结果其中，表2与表1中的探针对依次对应。从表2可以看出，本发明提供的人EGFR基因突变检测试剂盒以及使用该试剂盒检测人EGFR基因突变，可检测低至1pM的序列含量的样本，检测灵敏度高；检测得到的数值的变动范围均在15％以下，有的甚至低至3％左右，检测稳定性好。此外，检测不同浓度的阴性样品和阳性样本，其检测得到的数值均有很好的线性关系。另外，对系列浓度梯度的野生型序列样本和突变型序列样品，进行3次独立测试，每次样品测试20个复孔，野生样品测得的数值结果判读为野生则为符合，反之为不符合；突变样品测得的数值结果判读为突变则为符合，反之亦反，具体结果如表3所示。表3符合率另外，采用本实施例的方法对临床上已经确认基因突变类型的190例的唾液样本(突变70例，野生120例)、220例血浆样本(突变85例，野生135例)和200例胸腔积液样本(突变90例，野生110例)对不同的探针对进行双盲测试，测试结果与临床检测结果进行对比，检测结果见表4。表4检测结果样本阳性符合率阴性符合率血浆98.8％100％唾液98.6％100％胸腔积液98.9％100％另外，对不同样本的检测数据如表5-7所示。表5唾液样本的具体检测情况表6血浆样本的具体检测情况表7胸腔积液样本的具体检测情况其中，表4中的阳性符合率和阴性符合率的计算公式如表8所示。表8样本统计阳性符合率＝a/(a+c)×100％；阴性符合率＝b/(b+d)×100％。从表4-7可以看出，不论是血浆样本还是唾液样本还是胸腔积液样本均有较好的临床检测符合率，准确率高，超过95％以上，满足临床检测应用的需求。上述方法对阴性样本和阳性样本进行检测时，检测得到的电流值差异大，能很好的区分不同的样本。如对唾液的阴性样本采用34探针对进行检测，得到的电流值在41.6～65.6(-nA)，而阳性样本的电流值在88.4～141.4(-nA)；相应地，对同样的血浆样本，阴性样本得到的电流值在40.1～63.7(-nA)，而阳性样本的电流值在83.6～139.2。另外，改变试剂盒中的各组分的浓度，进行检测，结果同上述结果基本一致。综上可知，本发明提供的人EGFR基因突变检测试剂盒以及使用该试剂盒检测人EGFR基因突变，操作简便，样本无创，并且所需样本少，整个检测过程可以在半小时内完成；具有灵敏性好，可以达0.1％，准确率高，超过95％以上；成本低，与NGS相比，成本节约90％以上；易于操作，对操作人员要求低。实施例2对待检测样本进行检测，具体步骤如下：1、捕获探针固定在检测孔板的板底1.1pyrrole与捕获探针(简称CP)的混合液配制：捕获溶液含有以下成分：噻吩的重量百分数为5％，NaCl的浓度为2mol/L，捕获探针的浓度为1.5μmol/L。1.2加样：在96孔的检测孔板上，每个孔加入20μl的已配制好的pyrrole与CP混合液，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打检测孔板使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后立刻到EFIRM检测仪上进行电场操作。1.3EFIRM电场处理：在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：500mV，1s；电压B:1500mV，1s；进行10个循环。电场处理完毕，立刻取出，清洗检测孔板。1.4检测孔板清洗：在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(2bottom，2top)，洗液选择2XSSC(0.06％SDS)。清洗完毕，立刻进行下一步样本上样操作。2、样本杂交：2.1杂交buffer预处理杂交buffer(使用
发明内容中的杂交buffer3)在水浴锅中95℃水浴处理5min，然后室温放置冷却。2.2样本的配制样本从-20℃冰箱取出，放进4℃冰箱解冻。完全溶解后，样本与杂交buffer按体积比1:2.5混合，涡旋振荡后离心，即可上样进行检测。2.3加样：在检测孔板上，在对应的孔里加入空白对照buffer、相应浓度的阴性对照(WT)和阳性对照(MT)，上样量80μl。加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打检测孔板使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后立刻到EFIRM上进行电场操作。2.4EFIRM电场处理：在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：500mV，1s；电压B:800mV，1s；进行10个循环。电场处理完毕，立刻取出，清洗检测孔板。2.5检测孔板清洗：在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(2bottom，2top)，洗液选择2XSSC(0.06％SDS)。清洗完毕，立刻进行DP加样操作。3、检测杂交3.1DP(检测探针)溶液配制：检测溶液是以PBS作为溶剂，其中酪蛋白的重量百分数为5％，检测探针的浓度为1.5μmol/L，涡旋震荡混匀，离心，备用。3.2加样：根据实验设计在对应的孔加入对应DP溶液20μl，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打检测孔板使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后立刻到EFIRM上进行电场操作。3.3EFIRM电场处理：在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：500mV，1s；电压B:800mV，1s；进行8个循环。电场处理完毕，立刻取出，清洗检测孔板。3.4检测孔板清洗：在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(2bottom，2top)，洗液选择2XSSC(0.06％SDS)。清洗完毕，立刻进行加样操作。4、ReporterHybridization4.1Poly-HRP溶液配制：以PBS作为溶剂，其中酪蛋白的重量百分数为5％，poly-HRP的体积百分数为0.2％(购自thermofisher，产品名称为PierceTMStreptavidinPoly-HRP，货号为21140，单位规格为0.5mL)，涡旋震荡混匀，离心，备用。4.2加样：根据实验设计在对应的孔加入Poly-HRP溶液20μl，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打检测孔板使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后盖上检测孔板盖子，实验台上室温孵育40min，计时器倒数计时。孵育时间到，立刻清洗检测孔板。4.3检测孔板清洗：在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(3bottom，3top)，洗液选择PBST(0.15％Tween20)。清洗完毕，立刻进行TMB加样操作。5、Readout5.1加样：根据实验设计在对应的孔加入TMB/H2O2溶液(购自thermofisher,产品货号为34022，名称为TurboTMB底物溶液)，每个孔加入80μl，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极。加完立刻到EFIRM上进行电场操作。5.2EFIRM电场读数：在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：-300mV，100s，得到电流读数。实施例3对待检测样本进行检测，具体步骤如下：1、捕获探针固定在检测孔板的板底1.1pyrrole与捕获探针(简称CP)的混合液配制：捕获溶液含有以下成分：苯胺的重量百分数为0.1％，NaCl的浓度为0.01mol/L，捕获探针的浓度为0.5μmol/L。1.2加样：在96孔的检测孔板上，每个孔加入80μl的已配制好的pyrrole与CP混合液，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打检测孔板使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后立刻到EFIRM检测仪上进行电场操作。1.3EFIRM电场处理：在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：200mV，5s；电压B:800mV，5s；进行3个循环。电场处理完毕，立刻取出，清洗检测孔板。1.4检测孔板清洗：在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(2bottom，2top)，洗液选择2XSSC(0.04％SDS)。清洗完毕，立刻进行下一步样本上样操作。2、样本杂交：2.1杂交buffer预处理杂交buffer(使用
发明内容中的杂交buffer6)在水浴锅中85℃水浴处理15min，然后室温放置冷却。2.2样本的配制样本从-20℃冰箱取出，放进4℃冰箱解冻。完全溶解后，样本与杂交buffer按体积比1:1.5混合，涡旋振荡后离心，即可上样进行检测。2.3加样：在检测孔板上，在对应的孔里加入空白对照buffer、相应浓度的阴性对照(WT)和阳性对照(MT)，上样量20μl。加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打检测孔板使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后立刻到EFIRM上进行电场操作。2.4EFIRM电场处理：在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：200mV，5s；电压B:300mV，5s；进行3个循环。电场处理完毕，立刻取出，清洗检测孔板。2.5检测孔板清洗：在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(2bottom，2top)，洗液选择2XSSC(0.04％SDS)。清洗完毕，立刻进行DP加样操作。3、检测杂交3.1DP(检测探针)溶液配制：检测溶液是以PBS作为溶剂，其中酪蛋白的重量百分数为0.1％，检测探针的浓度为0.5μmol/L，涡旋震荡混匀，离心，备用。3.2加样：根据实验设计在对应的孔加入对应DP溶液30μl，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打检测孔板使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后立刻到EFIRM上进行电场操作。3.3EFIRM电场处理：在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：200mV，5s；电压B:300mV，5s；进行3个循环。电场处理完毕，立刻取出，清洗检测孔板。3.4检测孔板清洗：在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(2bottom，2top)，洗液选择2XSSC(0.04％SDS)。清洗完毕，立刻进行加样操作。4、ReporterHybridization4.1Poly-HRP溶液配制：以PBS作为溶剂，其中酪蛋白的重量百分数为0.1％，poly-HRP的体积百分数为0.05％(购自thermofisher，产品名称为PierceTMStreptavidinPoly-HRP，货号为21140，单位规格为0.5mL)，涡旋震荡混匀，离心，备用。4.2加样：根据实验设计在对应的孔加入Poly-HRP溶液20-80μl，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打检测孔板使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后盖上检测孔板盖子，实验台上室温孵育20-40min，计时器倒数计时。孵育时间到，立刻清洗检测孔板。4.3检测孔板清洗：在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(3bottom，3top)，洗液选择PBST(0.05％Tween20)。清洗完毕，立刻进行TMB加样操作。5、Readout5.1加样：根据实验设计在对应的孔加入TMB/H2O2溶液(购自thermofisher,产品货号为34022，名称为TurboTMB底物溶液)，每个孔加入30μl，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极。加完立刻到EFIRM上进行电场操作。5.2EFIRM电场读数：在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：-100mV，40s，得到电流读数。同样地，采用本发明实施例2和3提供的方法与实施例1相同的方式进行检测，得到的结果与实施例1结果基本一致。可见，本发明提供的人EGFR基因突变检测试剂盒以及使用该试剂盒检测人EGFR基因突变，操作简便，样本无创，并且所需样本少，整个检测过程可以在半小时内完成；具有灵敏性好，可以达0.1％，准确率高，超过95％以上；成本低，与NGS相比，成本节约90％以上；易于操作，对操作人员要求低。尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。当前第1页1 2 3