一株氯氰菊酯降解菌分离纯化及其菌粉的制备和应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，具体来说是一株氯氰菊酯降解菌分离纯化及其菌粉的制备和应用。

背景技术：

氯氰菊酯(Cypermethrin)是最常用的拟除虫菊酯类农药之一，广泛应用于农作物、牲畜等害虫的防治。但随着氯氰菊酯的频繁使用，有关该农药的残留问题及其危害性也日益暴露出来。已有研究显示，氯氰菊酯对某些有益昆虫及水生生物具有很高的毒性，对人体具有神经毒性、蓄积毒性及生殖毒性，已被美国环境保护局列为致癌物质。

生物降解是解决农药残留的新途径之一，但目前对于氯氰菊酯降解菌株的研究报道有限，且由于土壤环境复杂，菌株实际降解能力难以达到实验室水平，可应用于降解环境农药残留的微生态制剂的制备更是少有报道。因此筛选可有效降解氯氰菊酯残留的环境友好型菌株，开发可应用于环境修复的微生态制剂，不仅可以丰富氯氰菊酯降解菌群，而且可为其在自然环境中生物修复的应用提供理论依据。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株氯氰菊酯降解菌分离纯化及其菌粉的制备和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一株氯氰菊酯降解菌，该菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)BBCP-017，于2016年8月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.12886。

进一步的，该菌株的生物学特征如下：革兰氏阳性，淀粉水解实验、葡萄糖发酵、硝酸盐还原、V-P反应、明胶液化、溶菌酶、甲基红实验、H₂O₂酶实验、接触酶、需氧性实验均为阳性，乳糖发酵产酸、吲哚实验、硫化氢和柠檬酸盐实验均为阴性。

本发明还提供一种含有氯氰菊酯降解菌的菌粉。

本发明还提供一种氯氰菊酯降解菌的菌粉的制备方法，其步骤如下：将氯氰菊酯降解菌接种至种子培养基，于34～40℃振荡培养12～36h，再转接至发酵培养基在，于34～40℃振荡发酵培养48～72h，置于-20～-80℃冷冻处理1～8h，再于78～85℃水浴处理1～4h，3000～8000rpm离心10～30min，在无菌条件下收集菌泥复溶于0.8～1.5％NaCl溶液中，进行二次离心，3000～5000rpm离心10～30min，随后将得到的二次离心菌泥与冻干保护剂按照1:1～5的重量比混合均匀，-38～-42℃真空冷冻干燥后制成含菌量为0.5～2.5×10¹¹CFU/g的菌粉。

进一步的：所述冻干保护剂的配方为：脱脂奶粉5～20％、葡萄糖0.5％～5％，蒸馏水1000mL。

进一步的：所述冻干保护剂pH为pH 6.3～6.8。

本发明还提供一种氯氰菊酯降解菌菌粉在降解氯氰菊酯中的应用。

进一步的，将菌粉按质量体积百分比为0.001％～0.005％的比例复溶于无菌水或1～15％脱脂奶粉溶液中，再将菌粉悬液按照体积比1～5:100的比例添加至含氯氰菊酯的发酵培养基中。

本发明的有益技术效果是：

1、本发明筛选的蜡样芽孢杆菌BBCP-017菌粉复溶于无菌水后加入含60mg/L氯氰菊酯的发酵培养基培养3d后，降解率达87.4％；说明本发明的蜡样芽孢杆菌BBCP-017菌粉具有环境生物修复的应用价值以及广阔的应用前景。

2、菌粉制备工艺简单易行，适合工业化生产，具有含活菌数量高、保质期长、使用简单、使用量少等优点，菌粉使用方便，操作简单，只需要简单复水或者溶解于1～15％的脱脂奶粉溶液中，就可直接使用，不需要连续扩培繁殖传代，减少不必要的浪费；菌粉应用于实验室条件中能有效降解体系中的氯氰菊酯，是可能应用于受氯氰菊酯污染环境的生物修复剂，产品性能稳定，可在4℃以下冷冻保存，保质期长达36月；在室温条件下也可维持18月的发酵活力；同时方便运输，适合长距离配送。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1本发明蜡样芽孢杆菌BBCP-017显微油镜图(×1000倍)；

图2本发明氯氰菊酯标准曲线；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1蜡样芽孢杆菌BBCP-017的分离、纯化

①土样处理：采自长期施用氯氰菊酯的耕地土壤，经自然风干过80目筛备用。

②降解菌的富集驯化：取1.0g土样加入氯氰菊酯浓度为20mg/L的基础盐培养基，于37℃振荡(180rpm)培养24h后，取5％(v/v)培养液转接至氯氰菊酯浓度为40mg/L的基础盐培养基中，按照上述操作连续转接3次，培养基中氯氰菊酯浓度逐次提高至160mg/L。

③降解菌的筛选纯化：驯化后，将菌液(OD_600nm＝1.0)进行梯度稀释涂布转接到氯氰菊酯浓度为40mg/L的固体平板上，37℃培养24h，挑取单菌落于相同的固体平板连续划线纯化三代，挑选出菌落形态规则、生长速度最快的氯氰菊酯降解菌株BBCP-017；并将其保存于种子斜面，备用。

④氯氰菊酯降解菌株BBCP-017经形态、生理、分子鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)；该菌株已于2016年8月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.12886。该菌株的显微镜放大图如图1所示。

⑤上述培养基的配方由以下重量体积比计的组分组成。基础盐培养基：(NH₄)₂SO₄0.05～0.25％，KH₂PO₄ 0.05～0.25％，K₂HPO₄ 0.05～0.25％，MgSO₄ 0.05～0.25％，NaCl 0.05～0.25％，蒸馏水1000mL，pH 6.8～7.5；种子培养基：胰蛋白胨0.5～1.5％，酵母浸出粉0.25～1％，NaCl 0.25～1.5％，蒸馏水1000mL，pH 6.5～7.5；固体培养基同液体培养基加入2.0％的琼脂；121℃灭菌20min。灭菌后在无菌条件下加入一定体积的氯氰菊酯溶液使其为试验所需浓度，混匀备用。

实施例2蜡样芽孢杆菌BBCP-017菌粉的制备

①种子液制备：从实施例1中保存的种子斜面中挑取蜡样芽孢杆菌BBCP-017菌落，接种于50mL种子培养基中，初始pH 7.0，37℃振荡(180rpm)培养24h，即为种子液。

②发酵培养：以5％(v/v)的接种量接种至发酵培养基中，锥形瓶装液量为250mL/500mL，初始pH 7.0，37℃振荡(180rpm)培养48h，结束培养。

③收集菌体：将发酵培养液于-40℃冷冻处理4h，取出，再于80℃水浴处理2h，制片经孔雀绿染色，镜检观察，芽孢率达95％以上；以4000rpm离心20min，在无菌条件下，去除发酵上清液，收集菌泥复溶于1％NaCl溶液中，4000rpm离心20min，除出上清液，将冻干保护剂与二次离心菌泥按1:1～5的质量比混和均匀，备用。

④真空冷冻干燥：将菌泥混合物于-40℃真空冷冻干燥12h，得到均匀的淡黄色晶体形固体。在无菌密封条件捣碎下制成蜡样芽孢杆菌BBCP-017菌粉，置于铝膜袋中，抽真空得成品。

⑤活化计数：取0.100g蜡样芽孢杆菌BBCP-017菌粉复溶于100mL无菌水中，共三组平行，在无菌条件下将复溶菌粉悬液连续稀释5次，每次三个重复，使其稀释倍数依次为10、1×10²、1×10³、1×10⁴、1×10⁵，再分别取0.1mL稀释液于平板中，倾注发酵培养基混匀于37℃倒置培养16h观察菌落生长情况；最终在三组稀释倍数为1×10⁵的平板中平均菌落数依次为52、94、247，即本发明的蜡样芽孢杆菌BBCP-017菌粉含菌量为0.5～2.5×10¹¹CFU/g。

⑥冻干保护剂的配方由以下重量体积比计的组分组成：脱脂奶粉5～20％，葡萄糖0.5％～5％，蒸馏水1000mL，pH 6.3～6.8，115℃灭菌20min。

⑦发酵培养基的配方由以下重量体积比计的组分组成：胰蛋白胨0.3～1.5％，酵母浸出粉0.3～1.5％，NaCl 0.3～1.5％，MnSO₄0.01～0.25％，蒸馏水1000mL，pH 6.5～7.5，121℃灭菌20min。

实施例3蜡样芽孢杆菌BBCP-017菌粉在实验室中的应用

①氯氰菊酯的检测及其标准曲线方程建立

高效液相色谱(HPLC)检测：试验为每个处理3个重复，每个重复摇匀吸取一定量培养液，取培养液1.0mL并加入适量乙腈于10mL具塞试管中，超声波(40kHz，100W)辅助提取60min后用乙腈定容，混匀后12000rpm离心30min，取上清液用0.45μm有机相滤膜过滤，收集滤液进行。

HPLC检测条件：色谱柱为Inertsil ODS-3(5.0μm，150mm×4.60mm(i.d.))，流动相为乙腈-超纯水(90∶10，v/v)，流速为1.0mL/min，柱温为25℃，检测波长为210nm，进样量为10μL。

标准曲线线性方程：配制浓度为10mg/L的氯氰菊酯标准液，上机进样量依次为1、2、5、10、20、50μL，即质量分别为0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5μg；拟合氯氰菊酯质量-峰面积的标准曲线线性方程。

实验中氯氰菊酯降解率计算公式按下式进行：

式中，C为实验组氯氰菊酯残留浓度；C₀为对照组中氯氰菊酯残留浓度。

氯氰菊酯标准曲线如图2所示，其线性方程为y＝10623935.4350x+54940.4695，其相关系数R²为0.9990，表明线性关系良好。

②实验室应用试验

在无菌条件下，准确称取0.100g蜡样芽孢杆菌BBCP-017菌粉复溶于100ml无菌水中，以3％(v/v)的接种量接种至含60mg/L氯氰菊酯的发酵培养基，初始pH 7.0，锥形瓶装液量为100mL/250mL，37℃振荡(180rpm)培养72h；对照组为无菌粉悬液的含氯氰菊酯发酵培养基，每间隔12h采用HPLC法测定实验组和对照组的氯氰菊酯残留量。

发酵培养基氯氰菊酯残留测定结果见表1。可知，实验组氯氰菊酯降解迅速，尤其在12～48h时，氯氰菊酯的降解速率较大；经过72h培养后，对照组氯氰菊酯浓度由最初的59.35mg/L降至54.26mg/L，实验组氯氰菊酯浓度降至6.81mg/L，降解率达87.4％。

表1发酵培养基中氯氰菊酯残留量的变化

本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。

最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。