一种短小非编码RNA及其应用的制作方法

本发明涉及一种短小非编码RNA，尤其涉及一种miR-219a-5p在制备抗甲基苯丙胺成瘾药物中的应用。
背景技术：
：甲基苯丙胺(METH)，俗称冰毒，是一种白色苯丙胺类合成类毒品。高剂量或长期反复使用者会共患精神疾病，包括抑郁、躁狂、精神分裂等，严重者会造成中毒性精神病，表现为被害妄想和幻觉，过度使用甚至出现自杀和杀人倾向。在冰毒的戒断期间，冰毒依赖者会出现失眠、抑郁、躁狂、以及焦虑的精神情绪变化，而这些戒断反应也成为影响冰毒依赖者成瘾的主要生理因素。甲基苯丙胺成瘾共患精神疾病的比例达到了20-30％，成瘾者通常会出现抑郁、焦虑、精神分裂等症状。甲基苯丙胺也会产生严重的神经毒性，长期使用甲基苯丙胺可以造成认知功能损害。因此甲基苯丙胺成瘾机制的研究以及治疗药物的寻找，也逐渐向其它精神和神经系统疾病延伸。外周肾素-血管紧张素系统(RAS)对心血管系统的功能、电解质和体液的平衡，以及血压调节具有重要的作用。肾素经肾静脉进入血液循环，启动链式反应，由血管紧张素原逐步生成血管紧张素I(AngI)和II(AngII)，并进一步产生AngIII和AngIV等递质。除了在外周系统，中枢也存在一个相对独立的RAS系统，主要组成部分是AngII。中枢AngII是一个具有多效性的神经肽，存在于神经元细胞体、轴突和神经末梢上，对中枢起着多重调节作用。AngII的主要受体有两种ATR1和ATR2。中枢AngII主要通过与ATR1结合在中枢系统发挥调节内分泌、交感和应激系统的作用。ATR1型受体又分为ATR1a和ATR1b两种亚型。研究也表明中枢AngII和多种神经和精神疾病的发病机制存在相关性，包括阿尔茨海默症、帕金森症、神经性炎症、中风、双向人格障碍、癫痫等。迄今为止，还没有一个针对甲基苯丙胺成瘾治疗的有效药物。中枢AngII在多种精神和神经系统疾病的潜在作用以及申请者研究组的前期工作提示，中枢AngII以及ATR1可能会从改善和治疗甲基苯丙胺成瘾以及共患精神障碍，为甲基苯丙胺成瘾治疗药物的研究提供新的靶点。1992年在秀丽隐杆线虫中首次发现microRNA。之后，大量的研究表明miRNAs在基因表达中具有至关重要的作用。miRNAs是一种短小非编码的RNA，它只有21-25个核苷酸序列。miRNA首先在细胞核内转录出较长的初级miRNA，然后在核内由Drosha加工成60～70个核苷酸的发夹状RNA，即前体miRNA，在Exprotin-5复合物的帮助下被转运出胞核，在胞浆中由Dicer剪切成为成熟miRNA，随即被整合进RNA沉默复合物。miRISC通过与3’端靶非编码区，根据碱基配对原则靶向信使RNA来抑制基因的翻译或者诱导mRNA的降解。最近，越来越多的研究者的目光聚焦miRNA在各种成瘾性药物中的调节作用，包括可卡因、海若因、苯丙胺类和酒精。长期可卡因使用引起海马中miR-134和miR-135a的下调,也可以上调纹状体中的miR-181a，miR-212以及下调尾壳核(CPU)miR-124。酒精成瘾与戒断导致miR-155和miR-375表达的上调。然而，目前大部分研究主要集中在miRNA在可卡因或者酒精成瘾中，甲基苯丙胺成瘾相关研究较少，甲基苯丙胺成瘾中的microRNA调节机制目前还不明确。技术实现要素：本发明所要解决的一个技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种短小非编码RNA。本发明所要解决的另一个技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种上述短小非编码RNA的应用。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该短小非编码的RNA，其特征在于：所述RNA为miR-219a-5p，其核苷酸序列为SEQIDNo.1。本发明还提供一种短小非编码的RNA在制备抗甲基苯丙胺成瘾药物中的应用。进一步地，所述药物由有效量包含序列表所示SEQIDNo.1的核酸和药学上可接受的载体或辅料组成。进一步地，所述的药物的有效剂量为6～20μl/kg。进一步地，所述的药物是注射药剂。与现有技术相比，本发明的优点在于通过大量的实验证实，在建立甲基苯丙胺大鼠模型中，甲基苯丙胺引起microRNA在伏隔核表达发生变化，靶向AT1的miR-219a-5p伏隔核过表达后，对大鼠甲基苯丙胺引起的成瘾行为起到抑制作用，说明miR-219a-5p可以应用到治疗甲基苯丙胺成瘾，以开发作为基因治疗戒毒。附图说明图1为本发明中甲基苯丙胺成瘾模型的建立；图2为本发明中甲基苯丙胺引起miR-219a-5p在伏隔核中表达量的比较图；图3为本发明中甲基苯丙胺引起中枢血管紧张素系统的microRNA聚类图；图4为本发明中靶向中枢血管紧张素系统的microRNA；图5为本发明中中枢血管紧张素系统microRNA的表达变化图；图6为本发明中miR-219a-5p伏隔核过表达对固定频率给药行为的抑制作用；图7为本发明中miR-219a-5p伏隔核过表达对累进频率给药行为的抑制作用；图8为本发明中FR中miR-219a-5p过表达对血管紧张素II受体1表达的干预；图9为本发明中PR中miR-219a-5p过表达对血管紧张素II受体1表达的干预。具体实施方式以下通过结合附图及实施例对本发明作进一步说明本发明实施例中使用的甲基苯丙胺为标准品，来自宁波市微循环与莨菪类药研究所，miR-219a-5p来自上海吉玛制药技术有限公司。实施例1甲基苯丙胺静脉自身给药模型的建立静脉自身给药(IntravenousDrugSelf-Administration)是研究药物成瘾最经典的动物模型之一，静脉自身给药模型是反映用药者主动觅药和用药行为的经典动物模型，可以利用实验动物考察给药动机和主动强迫性用药行为。经典的大鼠甲基苯丙胺甲基苯丙胺自身给药模型可以很好的模拟临床上吸毒患者的甲基苯丙胺吸食行为，大鼠经过训练可以产生对甲基苯丙胺的自我给药，同时训练过程中不断上升的对甲基苯丙胺的行为反应率和给药量可以反映吸毒患者从一开始接触甲基苯丙胺到大量吸食甲基苯丙胺成瘾的这样一个过程。我们采用如下方法来建立大鼠的自身给药模型：首先，SD大鼠进行颈静脉插管手术，在右颈静脉插入一段PE管，并经背部穿出体外，手术后抗菌和恢复一周以上。随后，大鼠分别在自身给药操作笼内进行训练，每次训练前连通大鼠背部的PE管与操作笼内的甲基苯丙胺注射系统；操作笼内设左右两个鼻触器，其中一个为有效鼻触器，大鼠触鼻一下有效鼻触器将获得一针甲基苯丙胺注射，同时操作笼内的笼灯亮起(作为一种伴药的线索)，计算机记录；另外一个为无效鼻触器，大鼠触鼻一下无效鼻触器没有任何甲基苯丙胺注射和灯光，仅计算机记录。两次甲基苯丙胺注射之间有20秒的不应期，期间触鼻有效鼻触器将不会有甲基苯丙胺注射和灯光，仅计算机记录，每天的甲基苯丙胺注射针数限制为50针(防止过量注射死亡)。32个操作笼采用大型服务器的计算机同时控制，自身给药训练软件为自主编写的AniLabV652，训练程序为固定比率的FR1，即大鼠触鼻一次有效鼻触器获得一针甲基苯丙胺注射。大鼠经过3天，每天4小时的训练后，有效触鼻反应率和注射量均明显上升，在最后几天趋于稳定，从而形成了稳定的甲基苯丙胺成瘾状态。a、方法：对大鼠进行颈静脉插管手术，之后恢复3天。恢复后，开始自身给药，分为两组，即甲基苯丙胺组和生理盐水组，每组6只老鼠。前三天是给药训练期，这个阶段让老鼠学会。学会后连续十四天给药。a)甲基苯丙胺组：配制溶度为0.12mg/ml的甲基苯丙胺，按照0.05mg/kg/infusion剂量给药。b)生理盐水组：该组为对照组，直接用生理盐水替代甲基苯丙胺进行给药。从图1可以看出，给药次数甲基苯丙胺组显著高于生理盐水组，并维持在一定水平上，说明甲基苯丙胺组已经成瘾，并且自身给药模型已经建立好。实施例2采用上海吉玛制药技术有限公司qRCR检测试剂盒对miR-219a-5p的表达进行检测①miR-219a-5p逆转录反应体系(20μl)：组分体积1rxns5XMMLVRTBuffer4μldNTP(10mM)0.75μlMiRAN&U6snRNARTprimermix(1μM)1.2μlRNasin(40U/μl)RNase-freeH2O代替0.25μlMMLVReverseTranscriptase(200U/μl)0.2μlRNASampleXμlRNase-freeH2OTo20μl以上体系混匀后，25℃孵育30分钟，42℃孵育30分钟，85℃孵育5分钟，4℃备用。②microRNAreal-timePCR(PCR试剂盒源于上海吉玛制药技术有限公司，miR-219a-5p的引物由上海吉玛制药技术有限公司合成)引物为：FPrimer:CTGATTCCCTGATTGTCCAAACRPrimer:TATGCTTGTTCTCGTCTCTGTGTC组分体积1rxns2XReal-timePCRMasterMix(SYBR)1X10μlmiRAN/U6snRNAspecificPrimerset(10μM)0.2μM0.4μlROXreferencedye(50X)SterilizedH2O代替1Xor5X0.4or2μlTaqDNApolymerase(5U/μl)1U0.2μlmiRNARTproduct2μlSterilizedH2OTo20μl③实时定量PCR反应程序通过qRT-PCR方法扩增DNA来鉴定得到的即为目的RNA(miR-219a-5p，其核苷酸序列为序列1)。④结果显示，甲基苯丙胺模型大鼠伏隔核中miR-219a-5p含量较对照正常组小鼠有明显下降，说明在甲基苯丙胺大鼠伏隔核中，miR-219a-5p表达水平下降(结果如图2所示)。实施例3靶基因预测根据筛选出来的表达有差异的microRNA，进行靶基因预测(基于TargetScan与KEGGpathway等数据库)，筛选出与目标microRNA。图3聚类图，直观反映microRNA表达状态，图4可以看出，在众多表达差异的microRNA中，经过靶基因预测，有26个与中枢血管紧张素系统有关。从图5中，可以看出miR-219a-5p的表达倍数最高，这就是本发明的目标。实施例4miR-219a-5p大鼠伏隔核过表达对甲基苯丙胺成瘾的影响为了明确靶向ATR1b的microRNA对甲基苯丙胺成瘾行为的干预效应。实验动物首先进行甲基苯丙胺自身给药训练，训练成功后，将实验动物随机分为两组，一组为目标microRNA干预组(LV1-miR)和对照组(LV1CN)。分别将含有目标microRNA质粒的慢病毒和含有空质粒的慢病毒微注射到目标microRNA干预组和对照组的大鼠伏隔核内。手术恢复后，实验动物进行甲基苯丙胺自身给药的维持。采用FR和PR程序，比较两组动物在甲基苯丙胺自身给药维持期内FR和PR剂量效应曲线的走向，其中PR采用累进比率PR3-4程序来测定大鼠的Break-Point(断点)，不同于之前训练所用的固定比率程序，PR3-4程序测定下大鼠获得每次海洛因注射所要求的有效触鼻次数呈累进上升趋势，Break-Point的意义在于能够评价大鼠吸食海洛因的主观能动性，相当于临床患者吸食海洛因的动机。方法：选取24只训练成功的大鼠，分为两个大组FR组合PR组，每个大组12只大鼠，每个大组都分为LV1CN组和LV1-miR-219a-5p组，给大鼠做脑立体，将包装好的慢病毒注射到大鼠伏隔核(NAc)，LV1-miR-219a-5p组微注射含有目标microRNA的慢病毒，LV1CN组微注射含空质粒的microRNA。慢病毒注射剂量可为6-20μl/kg，此处注射量为14μl/kg。恢复7天后，将大鼠剂量效应曲线建立时，甲基苯丙胺所测剂量分别为0.025mg/kg、0.05mg/kg、0.075mg/kg、0.1mg/kg。每个剂量维持3天，并取平均值，得出每个剂量的每小时给药次数以及断点，最后分析FR、PR剂量效应曲线的走势。从图6，可以看出在0.05mg/kg、0.075mg/kg和0.1mg/kg剂量中，miR-219a-5p过表达明显抑制给药次数(p<0.01)，表明miR-219a-5p对强化给药FR有抑制作用。从图7，可以看出0.05mg/kg和0.075mg/kg剂量下，miR-219a-5p过表达明显抑制给药次数(p<0.001)，表明miR-219a-5p对给药动机PR有显著的抑制作用。实施例5miR-219a-5p大鼠伏隔核过表达在成瘾过程中对血管紧张素II受体1AT1表达的影响伏隔核(NAc)：接受前额皮层、海马、杏仁核的谷氨酸能神经传入，研究表明NAc参与了与成瘾有关的“刺激奖赏”学习，NAc的神经纤维主要终止于其外壳区，并与投射到VTA的GABA能神经元形成突触联系，直接参与与药物奖赏的动机和情绪活动。方法：①大鼠经过3天训练达到稳定的甲基苯丙胺成瘾状态，将SD大鼠分为两个大组FR组合PR组，每个大组12只大鼠，每个大组都分为LV1CN组和LV1-miR-219a-5p组，断头取脑，进行WesternBlotting实验，将NAc脑区剥离，分装在干净的研磨管中置于冰上待用。在各个研磨管中加入研磨珠、裂解液(RIPA)以及蛋白酶抑制剂，各种试剂准确加好后，置于研磨机中研磨30s后迅速取出置于冰上。5min后4℃13，000g下离心15分钟，离心后取其上清液，利用BCA试剂盒测定所取蛋白的浓度，并进行相应的调整使蛋白浓度尽量保持一致。随后在每管上清液中加入5x的蛋白缓冲液35ul并放在沸水浴中10min后冷却置于冰上待用。②电泳，将上述水浴后的样品，进行SDS-PAGE凝胶电泳，每个脑区做3个复孔。③转膜，转膜液要预冷NC膜要平衡预处理10至15分钟因为转膜液含甲醛，而且手袋有的甲蛋白会造成膜的污染，所以必须带上干净的手套。注意海绵要充分湿润，气泡要赶走干净，将夹子打开使黑的一面保持水平，在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。在海绵垫子上垫三层滤纸一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡，停止跑胶后要马上转膜否则蛋白会扩散导致条带发生变化进而影响实验结果。在分离胶和浓缩胶之间画一条线轻轻的拨开浓缩胶并把它移除，把NC膜盖在分离胶上面并且对齐加少许转膜液使膜保持在湿润的状态中膜下不能带有气泡。④免疫反应，将上述制好的膜放入盒中，将如封闭液(一般为脱脂奶粉)，常温封闭2小时或者4℃过夜。封闭完成后，去除封闭液，加入一抗过夜(或者常温5h)，一抗孵育完了后，回收一抗并用1X的TBST清洗3次每次5min，加入二抗，避光2h。避光结束后，回收二抗，并用1XTBST清洗3遍后在用1XTBS清洗1次。⑤显色，上述步骤完成后，将膜置于仪器上进行显色，并进行蛋白条带的观察和灰度值的测定。从图8可以看出，FR中，LV1-miR-219a-5p组相对于LV1CN组，AT1的表达显著下降(p<0.01)，说明miR-219a-5p过表达可以抑制AT1的表达。从图9可以看出，PR中，LV1-miR-219a-5p组相对于LV1CN组，AT1的表达显著下降(p<0.05)，说明miR-219a-5p过表达可以抑制AT1的表达。当前第1页1 2 3