一种基于吡咯双腙的荧光探针及其制备方法与应用与流程

本发明属于有机合成领域，具体涉及吡咯双腙及其制备方法和应用。

背景技术：

汞离子是目前最危险及最普遍的污染物之一。汞离子很容易被人体吸收，并且不容易被排出体外，它会进入食物链并且在高等生物体中富集，随后被人类摄入，作为最具毒性的金属离子之一，汞离子在人体内聚集会对大脑、神经系统、内分泌系统和肾脏造成严重的损害。此外，由于汞化合物的使用范围广，使得汞也成为一个重要的金属污染物。鉴于其对生命和环境的重要性，科学家们一直致力于采用荧光传感探针实现对汞离子在生物和环境系统中检测的研究。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种可检测二价汞离子的灵敏度高、选择性好的金属离子比色探针；另一目的是提供该探针的制备方法和应用。

本发明的技术方案是，一种基于吡咯双腙的荧光探针，所述吡咯双腙具有如下结构式：

本发明还提供了一种基于吡咯双腙的荧光探针的制备方法，其步骤如下：

S1：将5-甲酰-2，4-二甲基吡咯-3-甲酸乙酯首先用无水乙醇溶解，再加入水合肼；

S2：将S1所得混合物在常压下70-90℃回流，反应时间1-3h；

S3：将S2所得溶液冷却至室温后，有固体析出，减压过滤，取滤渣；

S4：将S3所得滤渣用醇溶液洗涤，得到基于吡咯双腙荧光探针。

所述S1中，5-甲酰-2，4-二甲基吡咯-3-甲酸乙酯与水合肼的物质的量之比为2：1。

所述S4中醇溶液为无水乙醇或浓度为75%的乙醇溶液。

所述的基于吡咯双腙的荧光探针的制备方法：将0.002-0.02mol的5-甲酰-2，4-二甲基吡咯-3-甲酸乙酯溶于0.01-0.05L无水乙醇中，再加入0.001-0.01mol的水合肼，常压下回流搅拌1-3h，冷却至室温后析出固体，减压过滤，将滤渣用无水乙醇洗涤得到基于吡咯双腙的荧光探针。

所述的基于吡咯双腙的荧光探针在检测细胞内二价汞离子中的应用。

本发明还提供了一种用于检测细胞中二价汞离子的荧光探针，所述荧光探针主要由上述吡咯双腙组成。

本发明提供的目标产物在重金属离子检测中的应用，对二价汞离子有很好的检测效果，与现有技术相比，本发明采用的原料易得，合成步骤简单，后处理亦很方便，较易实现大规模生产，具有快速、简便、灵敏度高、特异性强的特点，在检测生物活体中的二价汞离子方面有很大的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1制得的基于吡咯双腙的荧光探针的结构；

图2为本发明实施例1制得的基于吡咯双腙的荧光探针的核磁氢谱谱图；

图3为本发明实施例1制得的基于吡咯双腙的荧光探针的质谱谱图；

图4为本发明实施例1制得的基于吡咯双腙的荧光探针的乙腈/水(体积比1:1)溶液(5×10^-6 mol／L)对1当量不同金属离子(Ag⁺，Al³⁺，Ca²⁺，Cd²⁺，Co²⁺，Cr³⁺，Cu²⁺，Fe³⁺，Hg²⁺，K⁺，Mg²⁺, Mn²⁺，Na⁺，Ni²⁺，Pb²⁺，Zn²⁺，5×10^-6 mol／L)的荧光光谱图，激发波长为350 nm；

图5为本发明实施例1制得的基于吡咯双腙的荧光探针的乙腈/水(体积比1:1)溶液(5×10^-6 mol／L)滴定不同浓度二价汞离子的荧光光谱图；

图6在U251细胞中，吡咯双腙的荧光探针(5×10^-6 mol／L)与Hg²⁺的荧光成像图；Hela细胞用5×10^-6 mol／L上述荧光探针培育30分钟后加入Hg²⁺，继续培育30分钟后使用Olympus FV500-IX70激光共聚焦显微镜进行荧光成像。

其中：a为上述荧光探针明场下的成像图；b为上述荧光探针荧光成像；c为上述荧光探针明场图和荧光图叠加后的图片；d为上述荧光探针+Hg²⁺明场下的成像图；e为上述荧光探针+HgCu²⁺荧光成像图；f为上述荧光探针+HgCu²⁺明场图和荧光图叠加后的图片。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明，本发明实施例采用的试剂和原料为常规市场购买或参考文献合成得到。

实施例1：

吡咯双腙的合成

将0.39g5-甲酰-2，4-二甲基吡咯-3-甲酸乙酯溶于10mL无水乙醇中，再加入0.06 g85%水合肼，常压下78℃回流搅拌1h，冷却至室温后析出大量固体，减压过滤，将滤渣用无水乙醇洗涤得到淡黄色固体即为目标产物，目标产物的产率为85%。

单晶结构：吡咯双腙荧光探针乙醇溶剂合物的晶体结构图见图1；

核磁：¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆), δ (ppm): 11.74 (s, 2H, 2NH), 8.45 (s, 2H, 2CH=N), 4.16-4.21 (q, 4H, 2CH₂), 2.45 (s, 6H, 2CH₃), 2.33 (s, 6H, 2CH₃),1.26-1.30 (t, 6H, 2CH₃).具体核磁谱图见图2；

质谱：ESI-MS: m/z = 387.1938 for [M+H]⁺.具体质谱谱图见图3。

实施例2

所述的基于吡咯双腙的荧光探针的制备方法：将0.002mol的5-甲酰-2，4-二甲基吡咯-3-甲酸乙酯溶于50 ml无水乙醇中，再加入0.01mol的水合肼，常压下70℃回流搅拌3h，冷却至室温后析出固体，减压过滤，将滤渣用无水乙醇洗涤得到基于吡咯双腙的荧光探针。

实施例3

所述的基于吡咯双腙的荧光探针的制备方法：将0.02mol的5-甲酰-2，4-二甲基吡咯-3-甲酸乙酯溶于20 ml无水乙醇中，再加入0.01mol的水合肼，常压下80℃回流搅拌2h，冷却至室温后析出固体，减压过滤，将滤渣用无水乙醇洗涤得到基于吡咯双腙的荧光探针。

实施例4

所述的基于吡咯双腙的荧光探针的制备方法：将0.02 mol的5-甲酰-2，4-二甲基吡咯-3-甲酸乙酯溶于30 ml无水乙醇中，再加入0.001 mol的水合肼，常压下90℃回流搅拌1h，冷却至室温后析出固体，减压过滤，将滤渣用无水乙醇洗涤得到基于吡咯双腙的荧光探针。

吡咯双腙对二价汞离子的荧光性质测定

将上述制得的吡咯双腙作为荧光探针在乙腈/水(体积比1：1)介质中配制成摩尔浓度为5×10^-6 mol／L的溶液，分别在含摩尔浓度为5×10^-6 mol／L的Ag⁺，Al³⁺，Ca²⁺，Cd²⁺，Co²⁺，Cr³⁺，Cu²⁺，Fe³⁺，Hg²⁺，K⁺，Mg²⁺, Mn²⁺, Na⁺，Ni²⁺, Pb²⁺，Zn²⁺等金属离子的溶液中加入等量的上述荧光探针溶液，其中，Hg²⁺能够与吡咯双腙荧光探针反应产生蓝色荧光，具体见图4。

浓度为5×10^-6 mol／L的吡咯双腙作为荧光探针的乙腈/水(体积比1：1)溶液中分别加入浓度为0 mol／L，1×10^-6 mol／L，2×10^-6 mol／L，3×10^-6 mol／L，4×10^-6 mol／L，5×10^-6 mol／L，6×10^-6 mol／L，7×10^-6 mol／L，8×10^-6 mol／L，9×10^-6 mol／L，1×10^-5 mol／L的二价汞离子，采用荧光分光光度计对其分别进行荧光光谱分析（激发波长为350 nm），记录475 nm处的荧光强度值，所得的荧光光谱图见图5。通过附图5可以看出，随着二价汞离子浓度增加，吡咯双腙荧光探针在475 nm处的荧光发射逐渐增强，且发射峰强度与汞离子浓度在0-5×10^-6 mol／L范围内线性相关，检测限为1.02×10^-7 mol／L。

吡咯双腙作为荧光探针在细胞内汞离子的检测实验

U251细胞用5×10^-6 M的上述罗丹明6G衍生物作为荧光传感器培育5小时后加入Hg²⁺，继续培育5小时后使用Olympus FV500-IX70激光共聚焦显微镜进行荧光成像，获得在U251细胞的荧光成像图，具体如图6所示，其中a为上述荧光传感器明场下的成像图；b为上述荧光传感器荧光成像图；c为上述荧光传感器明场图和荧光图叠加后的图片；d为上述荧光传感器+Cu²⁺明场下的成像图；e为上述荧光传感器+Cu²⁺荧光成像图；f为上述荧光传感器+Cu²⁺明场图和荧光图叠加后的图片。U251细胞中加入上述吡咯双腙几乎不产生荧光，而再加入二价汞离子后，荧光强度明显增加。故本发明制得的吡咯双腙可用于细胞中二价汞离子的荧光探针。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，其保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内，本发明的保护范围以权利要求书为准。