本发明属于生物技术领域,特别是涉及一种色霉素A2、A3的生物合成及提取纯化工艺。
背景技术:
色霉素(Chromomycin)是一种糖基化聚酮化合物,属于金霉酸家族的成员。色霉素和金霉酸类其它大多数抗生素一样,已被研究证实具有良好的抗细菌、抗真菌以及抗癌活性。通过与位于DNA上富含GC的核苷酸序列相互作用,色霉素能够抑制依赖DNA的RNA聚合酶,并抑制mRNA的合成,从而抑制癌细胞的分裂增殖。特别是对像脑癌、睾丸癌等病毒性肿瘤,色霉素具有显著的抑制效果。此外,近期研究也发现,色霉素能够刺激K562细胞进行红系分化,在神经疗法上能够抑制神经细胞凋亡,并具备抗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的抗病毒活性。色霉素原产自灰色链霉菌7号,也是目前工业生产所采用的主要菌种。色霉素A3现已实现商业化生产,而色霉素A2与A4则是其生产过程中的副产物。产量较低、纯度不足是目前色霉素生产的最主要问题,这也导致其售价居高不下。本发明通过过表达激活基因SrcmRI,同时敲除抑制基因SrcmRII构建的工程菌实现色霉素A2、A3的高产,获得产物的纯度相较于传统生产方式更高,并且能够显著降低生产成本。
技术实现要素:
本发明为了解决上述现有技术中存在的缺陷和不足,提供了一种基于基因工程菌的色霉素A2、A3的高效生物合成及提取工艺。
本发明的技术方案:一种色霉素A2、A3的生物合成及提纯工艺,包括下述步骤:
(1)SrcmRI基因过表达工程菌SR1的构建
以纯化的链霉菌roseiscleroticus野生型菌株基因组DNA为模板,使用引物14-2-SARP-F-XbaI-NdeI:5’-AATCTAGAGGAGGAGCCCATATGAGCTCCGACAGCGACTGCA-3’和引物14-2-SARP-R-XbaI:5’-AATCTAGATCAGCCGGCCCGGCGCTGCC-3’,通过聚合酶链式反应扩增激活基因SrcmRI片段,扩增反应的条件为98℃15秒,60℃15秒,72℃30秒,30个循环,利用限制性核酸内切酶HindIII和XbaI将上述扩增得到的基因片段连接到大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pSET152的XbaI位点,即得本发明所需的SrcmRI基因过表达质粒pZJ183。参照《微生物学实验》(第4版)介绍的方法,将该pZJ183质粒通过原生质体转化导入链霉菌roseiscleroticus野生型菌株,即得本发明所需的重组工程菌株SR1。
(2)SrcmRII基因敲除工程菌SR2的构建
以纯化的链霉菌roseiscleroticus野生型菌株基因组DNA为模板,使用左臂引物PadRout-left-F-EcoRI:5’-AAAGAATTCTACTCGCCGGAGTGCGCACGGTCGAA-3’、PadRout-left-R-XbaI:5’-AAATCTAGACTTCTTCGCGCAGCTTGCGCAGCT-3’和右臂引物PadRout-right-F-XbaI:5’-AAATCTAGACGTACCGCTGTCGCCGCGAT-3’、PadRout-right-R-HindIII:5’-AAAAAGCTTATGATCTCGATCATCGAGCG-3’,通过聚合酶链式反应扩增一个包含有无功能ΔSrcmRII基因的2.3kb片段,扩增反应的条件为98℃15秒,60℃15秒,72℃100秒,30个循环。将上述扩增得到的片段克隆到大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pKC1139的EcoRI/HindIII位点,即得本发明所需的SrcmRII基因敲除质粒pZJ196。参照《微生物学实验》(第4版)介绍的方法,通过接合作用将基因敲除质粒pZJ196导入到链霉菌roseiscleroticus野生型菌株,将包含基因敲除质粒pZJ196的链霉菌roseiscleroticus菌株在MS固体培养基上28℃下培养20天,再分别挑取单菌落到3mL的TSBY液体培养基中,在28℃下培养5天,然后取50μL培养液涂布到ISP4固体培养基上。在37℃下培养5天,长出的菌株即为本发明所需的单交换突变株。将上述筛选得到的单交换突变株接种到不含有安普霉素的TSBY固体培养基上,在28℃下培养3代,然后挑选相同克隆分别接种到含有安普霉素的TSBY固体培养基与不含有安普霉素的TSBY固体培养基上,在37℃下培养5天,筛选出不能在含有安普霉素的TSBY固体培养基上生长,但能够在不含有安普霉素的TSBY固体培养基上生长的菌落,即为本发明所需的双交换突变工程菌株SR2。
(3)SrcmRI基因过表达和SrcmRII基因敲除工程菌SR3的构建
将上述SrcmRI基因过表达质粒pZJ183通过接合作用导入到双交换突变株SR2中,即得本发明所需的同时具有SrcmRI基因过表达和SrcmRII基因敲除的突变工程菌株SR3。
(4)工程菌在液体培养基中的发酵及产物萃取
将链霉菌roseiscleroticus野生型菌株、SR1、SR2与SR3分别接种到装有500mL YEME液体培养基的2L三角瓶中,在28℃、250rpm下培养2-5天。将上述液体培养液于3000×g下离心,分离发酵液和菌体细胞。用500mL乙酸乙酯萃取发酵液,重复萃取三次,菌体细胞用500mL甲醇萃取三次,合并来源于发酵液和菌体细胞的萃取液,利用旋转蒸发仪进行减压蒸馏浓缩,浓缩后的产物溶解于10mL甲醇。
(5)工程菌在固体培养基上的培养及产物萃取
将链霉菌roseiscleroticus野生型菌株、SR1、SR2与SR3分别接种到YEME固体培养基上,在28℃下培养7天。各取500g上述固体培养基,捣碎至固形物尺寸小于0.5cm,然后加入500mL乙酸乙酯-甲醇-甲酸(89:10:1)萃取液,在28℃,200rpm下震荡30分钟,收集萃取液,再用500mL乙酸乙酯萃取固体残留物二次,合并萃取液。上述萃取液体在25℃,4000rpm下离心5分钟,收集上清液,旋转蒸发仪进行减压蒸馏浓缩,浓缩后的产物溶解于3mL甲醇。
(6)色霉素的纯化和分析
将上述(5)或(6)中的提取溶液在HPLC上用Agilent eclipse plus C18色谱柱(5μm,4.6×250mm)分离,用流速为1mL/min的包含0.1%甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脱,在45分钟内,乙腈-水的体积比由10:90逐渐提高到90:10,收集25.8-26.5分钟和29.4-30.3分钟的产物流出液,即为分离得到纯的化合物;对上述两个化合物进行核磁共振和质谱分析,证实这两个化合物分别是色霉素A3、色霉素A2。
与现有技术相比,本发明有益效果主要体现在:
(1)本发明通过基因工程菌的构建形成一套高产色霉素A2及A3的方法;
(2)本发明所采用的色霉素生产方法产量高,副产物少,产物提纯工艺简单;
(3)本发明操作过程易控制,无污染,生产成本低。
附图说明
图1为色霉素A2的结构图;
图2为色霉素A3的结构图;
图3为使用液相色谱纯化色霉素A2及A3的检测结果图;
图4为色霉素A2及A3的质谱检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例、附图和表格对本发明作进一步详细的说明,但并不是对本发明保护范围的限制。
实施例1
SrcmRI基因过表达工程菌SR1的构建
以纯化的链霉菌roseiscleroticus野生型菌株基因组DNA为模板,使用引物14-2-SARP-F-XbaI-NdeI:5’-AATCTAGAGGAGGAGCCCATATGAGCTCCGACAGCGACTGCA-3’和引物14-2-SARP-R-XbaI:5’-AATCTAGATCAGCCGGCCCGGCGCTGCC-3’,通过聚合酶链式反应扩增激活基因SrcmRI片段,扩增反应的条件为98℃15秒,60℃15秒,72℃30秒,30个循环,利用限制性核酸内切酶HindIII和XbaI将上述扩增得到的基因片段连接到大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pSET152的XbaI位点,即得本发明所需的SrcmRI基因过表达质粒pZJ183。参照《微生物学实验》(第4版)介绍的方法,将该pZJ183质粒通过原生质体转化导入链霉菌roseiscleroticus野生型菌株,即得本发明所需的重组工程菌株SR1。
上述链霉菌roseiscleroticus野生型菌株购自美国标准生物品收藏中心(ATCC),编号为ATCC 53903。pSET152质粒载体购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司;DNA聚合酶、限制性核酸内切酶HindIII和XbaI购自宝生物工程(大连)有限公司;引物14-2-SARP-F-XbaI-NdeI和14-2-SARP-R-XbaI订购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
实施例2
SrcmRII基因敲除工程菌SR2的构建
以纯化的链霉菌roseiscleroticus野生型菌株基因组DNA为模板,使用左臂引物PadRout-left-F-EcoRI:5’-AAAGAATTCTACTCGCCGGAGTGCGCACGGTCGAA-3’、PadRout-left-R-XbaI:5’-AAATCTAGACTTCTTCGCGCAGCTTGCGCAGCT-3’和右臂引物PadRout-right-F-XbaI:5’-AAATCTAGACGTACCGCTGTCGCCGCGAT-3’、PadRout-right-R-HindIII:5’-AAAAAGCTTATGATCTCGATCATCGAGCG-3’,通过聚合酶链式反应扩增一个包含有无功能ΔSrcmRII基因的2.3kb片段,扩增反应的条件为98℃15秒,60℃15秒,72℃100秒,30个循环。参照《微生物学实验》(第4版)介绍的方法,通过接合作用将基因敲除质粒pZJ196导入到链霉菌roseiscleroticus野生型菌株,将包含基因敲除质粒pZJ196的链霉菌roseiscleroticus菌株在MS固体培养基上培养20天,再分别挑取单菌落到3mL的TSBY液体培养基中,在28℃下培养5天,然后取50μL培养液涂布到ISP4固体培养基上。在37℃下培养5天,长出的菌株即为本发明所需的单交换突变株。将上述筛选得到的单交换突变株接种到不含有安普霉素的TSBY固体培养基上,在28℃下培养3代,然后挑选相同克隆分别接种到含有安普霉素的TSBY固体培养基与不含有安普霉素的TSBY固体培养基上,在37℃下培养5天,筛选出不能在含有安普霉素的TSBY固体培养基上生长,但能够在不含有安普霉素的TSBY固体培养基上生长的菌落,即为本发明所需的双交换突变工程菌株SR2。
所述MS固体培养基中各组分用量占MS固体培养基质量用量的百分比分别为:硝酸钾0.19%;硝酸铵0.165%;磷酸二氢钾0.017%;七水硫酸镁0.037%;二水氯化钙0.044%;碘化钾0.000083%;硼酸0.00062%;四水硫酸锰0.00223%;七水硫酸锌0.00086%;二水钼酸钠0.000025%;五水硫酸铜0.0000025%;氯化钴0.0000025%;乙二胺四乙酸二钠0.00373%;七水硫酸亚铁0.00278%;肌醇0.01%;甘氨酸0.0002%;盐酸硫胺素0.00001%;盐酸吡哆醇0.00005%;烟酸0.00005%;蔗糖3%;琼脂0.7%;灭菌;所述TSBY液体培养基中各组分用量占TSBY培养基质量用量的百分比分别为:胰蛋白胨1.5%;大豆蛋白胨0.5%;氯化钠0.5%;pH 7.2;根据所需灭菌后添加安普霉素50μg/mL;所述TSBY固体培养基中各组分用量占TSBY培养基质量用量的百分比分别为:胰蛋白胨1.5%;大豆蛋白胨0.5%;氯化钠0.5%;琼脂2%;pH 7.2;根据所需灭菌后添加安普霉素50μg/mL;所述ISP4固体培养基中各组分用量占ISP4固体培养基质量用量的百分比分别为:可溶性淀粉1%;磷酸氢二钾0.1%;七水硫酸镁0.1%;氯化钠0.1%;硫酸铵0.2%;碳酸钙0.2%;七水硫酸亚铁0.0001%;七水氯化锰0.0001%;琼脂2%;灭菌后添加安普霉素50μg/mL;
上述pKC1139质粒载体购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司;DNA聚合酶、限制性核酸内切酶HindIII和XbaI购自宝生物工程(大连)有限公司;引物PadRout-left-F-EcoRI,PadRout-left-R-XbaI,PadRout-right-F-XbaI和PadRout-right-R-HindIII订购自生工生物工程(上海)股份有限公司。上述的配制培养基所用的化学试剂购自杭州华东医药集团有限公司,生化试剂购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
实施例3
SrcmRI基因过表达和SrcmRII基因敲除工程菌SR3的构建
将上述SrcmRI基因过表达质粒pZJ183通过接合作用导入到双交换突变株SR2中,即得本发明所需的同时具有SrcmRI基因过表达和SrcmRII基因敲除的突变工程菌株SR3。
实施例4
工程菌SR3在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析
将SR3接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中,在28℃、250rpm下培养2天。取500mL的上述液体培养液于3000×g下离心,分离发酵液和菌体细胞。用等量乙酸乙酯进行3小时的发酵液萃取,重复操作三次,菌体细胞用500mL甲醇萃取三次,合并来源于发酵液和菌体细胞的萃取液,利用旋转蒸发仪进行减压蒸馏浓缩,浓缩后的产物溶解于10mL甲醇。
将上述溶液在HPLC上用Agilent eclipse plus C18色谱柱(5μm,4.6×250mm)分离,用流速为1mL/min的包含0.1%甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脱,在45分钟内,乙腈-水的体积比由10:90逐渐提高到90:10,收集在25.8-26.5分钟流出液,最终从工程菌SR3的液体培养物中分离得到110.2mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A3;收集在29.4-30.3分钟流出液,最终从工程菌SR3的液体培养物中分离得到137.5mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A2;色霉素A2及A3的结构如图1所示;色霉素A2及A3的核磁共振数据如表1所示;使用液相色谱纯化目标化合物过程的检测结果如图2所示;色霉素A2及A3的质谱检测结果如图3所示。
所述YEME液体培养基中各组分用量分别是:(以总体积1L为例)酵母提取物3g;细菌蛋白胨5g;麦芽浸粉3g;葡萄糖10g;蔗糖340g;灭菌。
上述的配制培养基所用的化学试剂购自杭州华东医药集团有限公司,生化试剂购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
实施例5
工程菌SR3在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析
将SR3接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中,在28℃、250rpm下培养3天。发酵液提取、纯化操作同实施例4;收集在25.8-26.5分钟流出液,最终从工程菌SR3的液体培养物中分离得到144.8mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A3;收集在29.4-30.3分钟流出液,最终从工程菌SR3的液体培养物中分离得到158.3mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A2。
实施例6
工程菌SR3在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析
将SR3接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中,在28℃、250rpm下培养4天。发酵液提取、纯化操作同实施例4;收集在25.8-26.5分钟流出液,最终从工程菌SR3的液体培养物中分离得到145.1mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A3;收集在29.4-30.3分钟流出液,最终从工程菌SR3的液体培养物中分离得到156.1mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A2。
实施例7
工程菌SR3在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析
将SR3接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中,在28℃、250rpm下培养5天。发酵液提取、纯化操作同实施例4;收集在25.8-26.5分钟流出液,最终从工程菌SR3的液体培养物中分离得到142.2mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A3;收集在29.4-30.3分钟流出液,最终从工程菌SR3的液体培养物中分离得到157.1mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A2。
实施例8
工程菌SR2在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析
将SR2接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中,在28℃、250rpm下培养2天。发酵液提取、纯化操作同实施例4;收集在25.8-26.5分钟流出液,最终从工程菌SR2的液体培养物中分离得到87.2mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A3;收集在29.4-30.3分钟流出液,最终从工程菌SR2的液体培养物中分离得到90.3mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A2。
实施例9
工程菌SR2在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析
将SR2接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中,在28℃、250rpm下培养3天。发酵液提取、纯化操作同实施例4;收集在25.8-26.5分钟流出液,最终从工程菌SR2的液体培养物中分离得到101.3mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A3;收集在29.4-30.3分钟流出液,最终从工程菌SR2的液体培养物中分离得到108.2mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A2。
实施例10
工程菌SR2在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析
将SR2接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中,在28℃、250rpm下培养4天。发酵液提取、纯化操作同实施例4;收集在25.8-26.5分钟流出液,最终从工程菌SR2的液体培养物中分离得到98.8mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A3;收集在29.4-30.3分钟流出液,最终从工程菌SR2的液体培养物中分离得到107.9mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A2。
实施例11
工程菌SR2在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析
将SR2接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中,在28℃、250rpm下培养5天。发酵液提取、纯化操作同实施例4;收集在25.8-26.5分钟流出液,最终从工程菌SR2的液体培养物中分离得到100.3mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A3;收集在29.4-30.3分钟流出液,最终从工程菌SR2的液体培养物中分离得到108.6mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A2。
实施例12
工程菌SR1在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析
将SR1接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中,在28℃、250rpm下培养2天。发酵液提取、纯化操作同实施例4;收集在25.8-26.5分钟流出液,最终从工程菌SR1的液体培养物中分离得到19.6mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A3;收集在29.4-30.3分钟流出液,最终从工程菌SR1的液体培养物中分离得到20.3mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A2。
实施例13
工程菌SR1在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析
将SR1接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中,在28℃、250rpm下培养3天。发酵液提取、纯化操作同实施例4;收集在25.8-26.5分钟流出液,最终从工程菌SR1的液体培养物中分离得到33.1mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A3;收集在29.4-30.3分钟流出液,最终从工程菌SR1的液体培养物中分离得到35.9mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A2。
实施例14
工程菌SR1在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析
将SR1接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中,在28℃、250rpm下培养4天。发酵液提取、纯化操作同实施例4;收集在25.8-26.5分钟流出液,最终从工程菌SR1的液体培养物中分离得到32.6mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A3;收集在29.4-30.3分钟流出液,最终从工程菌SR1的液体培养物中分离得到35.4mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A2。
实施例15
工程菌SR1在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析
将SR1接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中,在28℃、250rpm下培养5天。发酵液提取、纯化操作同实施例4;收集在25.8-26.5分钟流出液,最终从工程菌SR1的液体培养物中分离得到33.4mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A3;收集在29.4-30.3分钟流出液,最终从工程菌SR1的液体培养物中分离得到36.2mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A2。
实施例16
野生型菌株在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析
将链霉菌roseiscleroticus野生型菌株接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中,在28℃、250rpm下培养2天。发酵液提取、纯化操作同实施例4;收集在25.8-26.5分钟和29.4-30.3分钟流出液,最终未从链霉菌roseiscleroticus野生型菌株的液体培养物中得到色霉素A3或A2。
实施例17
野生型菌株在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析
将链霉菌roseiscleroticus野生型菌株接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中,在28℃、250rpm下培养3天。发酵液提取、纯化操作同实施例4;收集在25.8-26.5分钟和29.4-30.3分钟流出液,最终未从链霉菌roseiscleroticus野生型菌株的液体培养物中得到色霉素A3或A2。
实施例18
野生型菌株在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析
将链霉菌roseiscleroticus野生型菌株接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中,在28℃、250rpm下培养4天。发酵液提取、纯化操作同实施例4;收集在25.8-26.5分钟和29.4-30.3分钟流出液,最终未从链霉菌roseiscleroticus野生型菌株的液体培养物中得到色霉素A3或A2。
实施例19
野生型菌株在液体培养基中发酵及产物萃取、纯化和分析
将链霉菌roseiscleroticus野生型菌株接种到装有500mL YEME液体培养基的2L烧瓶中,在28℃、250rpm下培养5天。发酵液提取、纯化操作同实施例4;收集在25.8-26.5分钟和29.4-30.3分钟流出液,最终未从链霉菌roseiscleroticus野生型菌株的液体培养物中得到色霉素A3或A2。
实施例20
工程菌SR3在固体培养基上培养及产物萃取、纯化和分析
将SR3接种到YEME固体培养基上,在28℃下培养7天。各取500g上述固体培养基,捣碎至固形物尺寸小于0.5cm,然后加入500mL乙酸乙酯-甲醇-甲酸(89:10:1)萃取液,在28℃,200rpm下震荡30分钟,收集萃取液,再用500mL乙酸乙酯萃取固体残留物二次,合并萃取液。上述萃取液体在25℃,4000rpm下离心5分钟,收集上清液,旋转蒸发仪进行减压蒸馏浓缩,浓缩后的产物溶解于3mL甲醇。纯化操作同实施例5;收集在25.8-26.5分钟流出液,最终从工程菌SR3的固体培养物中分离得到198.3mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A3;收集在29.4-30.3分钟流出液,最终从工程菌SR3的固体培养物中分离得到231.8mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A2。
所述YEME固体液体培养基中各组分用量分别是:(以总体积1L为例)酵母提取物3g;细菌蛋白胨5g;麦芽浸粉3g;葡萄糖10g;蔗糖340g;琼脂20g;灭菌。
实施例21
工程菌SR2在固体培养基上培养及产物萃取、纯化和分析
将SR2接种到YEME固体培养基上,在28℃下培养7天。萃取操作同实施例20,纯化操作同实施例4;收集在25.8-26.5分钟流出液,最终从工程菌SR2的固体培养物中分离得到218.6mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A3;收集在29.4-30.3分钟流出液,最终从工程菌SR2的培养物中分离得到122.5mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A2。
实施例22
工程菌SR1在固体培养基上培养及产物萃取、纯化和分析
将SR1接种到YEME固体培养基上,在28℃下培养7天。萃取操作同实施例20,纯化操作同实施例4;收集在25.8-26.5分钟流出液,最终从工程菌SR1的固体培养物中分离得到43.9mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A3;收集在29.4-30.3分钟流出液,最终从工程菌SR1的培养物中分离得到44.4mg/L纯的化合物;对该化合物进行了核磁共振和质谱分析,证明该化合物是色霉素A2。
实施例23
野生型菌株在固体培养基上培养及产物萃取、纯化和分析
将链霉菌roseiscleroticus野生型菌株接种到YEME固体培养基上,在28℃下培养7天。萃取操作同实施例20,纯化操作同实施例4;收集在25.8-26.5分钟和29.4-30.3分钟的流出液,最终未从链霉菌roseiscleroticus野生型菌株的固体培养物中分离得到色霉素A3或A2。
附表1:色霉素A2、A3的1H NMR数据(300MHz)